细胞质量控制方法.pdfVIP

免疫学方法： 1，碱性磷酸酶AKP AKP 是一种单酯磷酸水解酶，它能在碱性条件下水解磷酸单酯释放磷酸，是一种膜结合金属 糖蛋白，由两个亚单位组成，许多研究结果表明，AKT 的高表达与未分化的多能干细胞相关。 ES 细胞中也都含有丰富的AKP ，而在已分化的ES 细胞中AKP 呈弱阳性或阴性，因此可以鉴 定ES 是否分化。AKP 染色步骤：PBS 冲洗，4 °固定，碱性条件下染色20min，双蒸水洗涤， 甘油封片，阳性结果为棕色。 2，特异性胚胎细胞表面抗原 （SSEA ） SSEA 是一种糖蛋白，它的表达在胚胎发育早期收到严密的调节，当细胞分化时这些抗原的 表达会出现明显变化，因此可以作为鉴定哺乳动物类ES 细胞分化的重要工具。分步染色法： PBS 洗涤，2%Trion 作用20min，PBS 洗涤，封闭液静置20min，PBS 洗涤，加一抗4 °过夜， PBS 洗涤，加二抗30°温育30min，PBS 洗涤，甘油封片，显微镜下观察是否出现荧光。 3，Oct-4 活性 Oct-4 基因是小鼠胚胎发育早期，生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一 种发育多能性的标志基因，近年研究表明，Oct-4 基因所表达的蛋白是ES 细胞全能性的标志， 因此可以用免疫荧光检测Oct-4 是否为阳性。 4 ，葡萄糖磷酸异构酶 （GPI ） GPI 是近交小鼠遗传检测中常用的一个生化标记基因，存在于小鼠个体的所有组织中，因而 被广泛应用于检测组织中ES 细胞的嵌合情况。 染色体相关鉴定： 1，核型分析：正常的ES 细胞是二倍体核型，但 ES 细胞的遗传组成会随着传代次数的增加 及培养时间的延长而变化，通过对染色体形态数目的分析可以了解细胞的形态特征和生长状 况，具体过程：胰酶消化处理成单细胞悬液，加秋水仙素处理使细胞停止在分裂中期，冰醋 酸甲醇固定液处理15min，吹散成干细胞悬液，将悬液滴于准备好的载玻片上，烘烤，胰酶 消化后Giemsa 染色，油镜下观察，分析整倍体数目，计算整倍体百分比。 2，染色体G 带技术 ES 细胞在体外增殖和传代过程中，新培养的细胞多能性若丧失染色体核型必然发生变化。 高分辨率分带技术可精确地识别染色体，判断核型是否正确，进而鉴定待测细胞是否是 ES 细胞。 3，端粒酶 端粒酶是一种核蛋白，由RNA 和蛋白质构成，具有反转录酶的活性，其中的RNA 富含G 序 列的模板，能延长染色体端粒的长度。在胚胎细胞、生殖细胞中端粒酶呈高水平表达，因此 这些细胞每次分裂后，可保持端粒长度，维持细胞的不死性，在 ES 细胞中，端粒酶的活性 很高。 全能性和多能性的鉴定 1，ES 细胞的诱导分化检测：ES 细胞发育多能性或全能性的检测关键在于ES 细胞在无分化 抑制物存在的条件下能否形成各种类型的组织细胞。因此可在体内或体外进行ES 细胞诱导 分化实验，通过检测所形成的组织细胞来鉴定ES 细胞的全能性或多能性。体外分化实验：1） 体外分化实验：将获得的细胞系制成悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中，如果是ES 细胞， 一段时间后，部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同组织，同时一部分不贴壁 的细胞悬浮生长，先生成简单类胚体，进一步培养生成囊状胚体。2 ）体内分化实验：将浓 5 度为10 /ml 的ES 细胞悬浮液注射到基因型相同或免疫缺陷小鼠的皮下或肾囊中，经过一段 时间后注射部位可形成畸胎瘤，取出畸胎瘤组织作常规石蜡切片，可观察到来源于外胚层、 中胚层和内胚层三个胚层的不同的细胞类型。 2，嵌合体的形成 嵌合体实验是验证ES 细胞全能性的重要实验，即ES 细胞与正常胚胎嵌合，如果产生包括生 殖系在内的各个组织器官，并能产生功能性配子的嵌合体，即可证实分离得到的ES 细胞具 有全能性的ES 细胞。一般采用胚泡注射或桑椹胚聚合法将供体的ES 细胞与受体胚泡结合在 一起，然后转移到假孕母体子宫中进一步发育，可得到嵌合体动物，随和可根据毛色、皮肤 颜色等外观指标进行判定，或取器官组织进行同工酶检测。 3，核移植 以ES 细胞做核供体注射到去核卵泡细胞中，产生重构胚。将重构胚移植到受体中，如果能 正常发育并产生个体，就证明ES 细胞具有全能性，这是检测ES 细胞全能性最有说服力的方 法。 鉴定次序： ES 细胞在体外分化抑制培养时，每18-24h 就分裂增殖一次，并能在体外持续传代几十甚至 上百次仍然保持正常的核型。在整个鉴定过程中，可以先检查 AKP 和核型，然后鉴定干细