分子生物学实验指导-3.pdfVIP

北京化工大学 分子生物学实验指导 实验一 少量质粒 DNA 的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的 DNA 分子，它是染色体外能够稳定遗传 得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代 细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活， 因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物 转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞 （如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代 谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的 DNA 分子 无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其 复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control） 复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期 的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含 1个或几个质粒 分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制， 当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝， 一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在 每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细 菌；分离和纯化质粒 DNA。目前应用于质体 DNA 的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法 （alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱 层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处 理质粒 DNA 及染色体 DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股 DNA，同时在急速中和反应中，染色体 DNA 因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂 乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒 DNA 因分子小，两 单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体 DNA分离。本实验所使用的pUC19含有 β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝 白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分 解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部 2 + 分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K 所含复合物一起沉淀下来，可离心去 除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。 三、实验方法 1.仪器用具: a. 无菌操作台(laminar flow) b. 台式型离心机(microcentrifuge) c. 微量吸管(pipetman) d. 真空干燥机(speed vac) e． 漩涡混合器 f． 琼脂糖凝胶电泳仪 2.材料: 实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并 o 在37 C下振荡培养过夜。 3.药品及试剂: a. Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0),