酶工程 第四章 酶的提取与分离 2013-3-苗条.ppt

第四章 酶的提取与分离 酶的提取（extraction）与分离（separation，isolation）纯化（purification）是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。 主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等 酶分离纯化路线 第一节 细胞破碎 cell disruption 胞外酶：细胞内产生以后，可以分泌到细胞外的酶 胞内酶：合成以后不分泌到细胞外，仍然存于细胞内的酶 溶酶：游离在细胞内 结酶：牢固与膜或细胞颗粒结合在一起 不同类型细胞产酶 动物细胞多为——胞外酶 植物细胞多为——胞内酶 微生物细胞为——胞外酶、胞内酶 胞外酶提取： 盐析、沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。 胞内酶提取： 收集菌体，破碎细胞后提取。 结酶：打断酶蛋白和细胞颗粒结合。 动物细胞需剔除结缔组织、脂肪组织等 植物材料如种子应去壳，以免单宁等物质着色污染。 细胞破碎方法及其原理 一、机械破碎法 二、物理破碎法 三、化学破碎法 四、酶促破碎法 第二节 提取 extraction 酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称为酶的抽提。 一、酶提取的方法 二、影响酶提取的主要因素 1、温度 温度↑，酶的溶解度 ↑，酶分子的扩散速度 ↑ 温度过高，酶容易变性失活 提取时温度不宜过高。有机溶剂提取时，温度在0~10℃。 有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸梅、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些温度下提取 在不影响酶的活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。 2、pH值 溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著的影响 为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点 但是除了酸溶液提取或碱溶液提取者以外，提取时溶液的pH值不宜过高或过低，以防止酶的变性失活 3、提取液的体积 提取液 ↑，提取率 ↑ 过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利 提取液的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。 分次提取 适当搅拌 加保护剂（底物，辅酶，抗氧化剂等） 第三节 沉淀分离 定义：沉淀分离就是改变某些条件或者加入某些物质， 使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他物质分离的技术过程。 沉淀分离主要方法 一、盐析沉淀法 简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 应用最早、至今广泛使用 主要用于蛋白类酶的分离纯化。 1、基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 原因： 加入少量盐↑，蛋白质上极性基团↑，蛋白质溶解度↑：盐溶。 高盐浓度，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。 2、溶解度影响因素 酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切，可表示为： 在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数。 某酶或蛋白质，在温度和pH值等盐析条件及所使用的盐确定（即β 、Ks确定）之后，酶或蛋白质的溶解度决定离子强度I。 离子强度I：指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。即： 例如，0.2mol/L的（NH4）2SO4溶液，其中，铵离子浓度为2×0.2mol/L，价数为十1；硫酸根离子浓度为0.2mol/L，价数为十2；其离子强度为： 3、分段盐析 Ks 分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（β为常数），根据不同蛋白质Ks 的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I 值)使不同的酶或蛋白质分离的方法。 β 分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下（I 为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。 4、盐的选择 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等 硫酸铵 溶解度大 25℃时，溶解度为767 g/L；在0℃时，溶解度为697 g/L） 不影响酶的活性 分离效果好 价廉易得 盐浓度的表示 饱和度 例如，70 mL酶液加入30 mL饱和硫酸铵溶液，则混合溶液中硫酸铵的饱和度为30/（30十70） ＝0.3。 饱和硫酸铵溶液的配制方法：在水中加入过量的固体硫酸铵，加热至50~60℃，保温数分钟，趁热滤去过量未溶解的硫