蛋白质的分离与纯化技术(2007-2008).pptVIP

蛋白质分离纯化的目的 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特性） 蛋白质稳定存在的影响因素 蛋白质分离纯化的一般程序 蛋白质的分离纯化方法 浓缩、干燥及保存 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯化的蛋白质样品。 研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构相。 制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除去。 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括 1.分子的大小和形状 2.酸碱性质（带电性质） 3.溶解度 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力 蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团 。 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。 蛋白质稳定存在的影响因素 蛋白质在生理条件下较为稳定，但纯化过程中的条件比生理环境要剧烈，这就要求采取一些措施来保护蛋白质的稳定性。 蛋白质稳定存在的影响因素 温度 缓冲溶液 蛋白酶 摇动剪切 高压 蛋白质分离纯化总目标 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。蛋白质的分离(separation，isolation)和纯化(purification)工作是生物化学中一项艰巨而繁重的任务。 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性(比活常以活力单位数／毫克蛋白质表示)。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程序 前处理 粗分级分离 细分级分离 (1) 前处理 (pretreatment) 分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 i) 材料的选择 ii）细胞的破碎 iii）蛋白质的溶解 i) 材料的选择 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。 对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： 1利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； 2利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织。 种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。 细胞破碎方法介绍 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 细胞破碎方法介绍 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 细胞破碎方法介绍 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶。 缺点：是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感的核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 细胞破碎基本规律 动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎，液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)等。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开 细胞破碎方法总结 iii）蛋白质（包括酶）的溶解(提取) 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 水溶液提取法 有机溶剂提取法 水溶液提取法 稀盐缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白