硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定论文.docVIP

　　硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定论文 马卫列,刘芳,何承伟,何振辉 【关键词】 蛋白 Purification of mouse endostatin in thioredoxin fusion expression system and identification of its biological activity 【Abstract】 AIM：To purify mouse endostatin by using thioredoxin fusion expression system and to identify its biological activity. METHODS: The pThioHisendo rebinant plasmid ed into BL21. After induction atography through Nicolumn. The purified protein embrane(CAM) angiogenesis inhibitory assay and endothelial cell proliferation inhibitory assay. RESULTS: High purity thioredoxinendostatin fusion protein ouse endostatin rebinant fusion protein expressed in E.coli by using thioredoxin fusion expression system is easy to be purified and possesses high activity. 【Key；fusion protein 【摘要】 目的：将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素（endostatin）进行纯化并对其生物学活性进行测定. 方法： 将含有pThioHisendo重组质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG（异丙基βD硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白，SDSPAGE分析表达产物为包涵体，将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素，经SDSPAGE分析鉴定. 将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定. 结果：经SDSPAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白，纯度可达95%，得率为0.27 g/L. 纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性，加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)％和(47.1±4.0)％.freelanaka等［2］实验发现，将含有内皮抑素基因的病毒注入小鼠脑瘤瘤体内可明显抑制肿瘤生长，减少瘤组织血管生成；刘江秋等［3］发现，重组血管内皮抑素能抑制小鼠黑色素瘤生长、转移及新生毛细血管的形成. 过去的抗癌药有较大的副作用，而内皮抑素通过与血管内皮细胞表面的整和素（integrin）结合抑制新生血管的形成［4］，控制肿瘤细胞的生长和转移，对正常细胞没有任何不良影响. 为了探讨内皮抑素用于肿瘤生物治疗的可行性，我们利用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中实现了对内皮抑素的高效表达，通过镍柱亲和层析对内皮抑素融合蛋白进行纯化，得到可溶性的内皮抑素融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行生物学活性鉴定，为以后大量生产及临床应用奠定基础. 1材料和方法 1.1材料硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA质粒由中国农业大学生物学院微生物系杨苏生教授惠赠；pThioHisAendo重组质粒由本室制备，Nickel Chelate Affinity Matrix(NiCAM)树脂购自Sigma公司，大肠杆菌BL21菌株为本室保存；甲叉双丙烯酰胺、溶菌酶、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、蛋白质标准Marker、脱氧胆酸钠、IPTG购自华美生物工程公司. 1.2方法 1.2.1实验分组①融合蛋白表达实验分为2组：加入IPTG至终浓度1 mmol/L的诱导组，诱导5 h；另一组为未加IPTG组. ②鸡胚囊膜（CAM）血管生成抑制实验分为3组：对照组（n=5），5 μg内皮抑素加样组（n=5），10 μg内皮抑素加样组（n=5）. ③内皮细胞抑制实验分为5组（每组n=5）：对照组，12.5，25，50和100 μg内皮抑素加样组. 1.2.2含目的基因的重组质粒pThioHisAendo融合蛋白的表达重组质粒转化感受态细菌：用0.1 mmol/L CaCl2处理BL21细菌，制备感受态细菌；加10 mg/L pThioHisendo重组质粒2 μL入10