Real time PCR - 扬州大学.PPTVIP

Real time PCR 扬州大学 生物科学与技术学院 原理 原理 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 原理 CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 Real-Time PCR成功的关键因素 Primer（引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （cDNA模板） Endogenous reference gene（内参基因） Reaction volume （反应体积） 引物设计原则 如何优化引物浓度 Real-Time PCR成功的关键因素 Primer（引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （cDNA模板） Endogenous reference gene（内参基因） Reaction volume （反应体积） 如何避免污染 用1.5ml Microtube 分装小体积样品 所有样品使用前必须离心 使用八连排反应管 用70%酒精擦拭所有器具及实验桌 计划好实验样品表格（三个重复） 耐心安静慢慢操作实验 随时保持双手干净 不可重复使用tip 不可使用八头 pipetman 不可在八连排反应管上贴标签或写字 Real-Time PCR成功的关键因素 Primer（引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （cDNA模板） Endogenous reference gene（内参基因） Reaction volume （反应体积） 第一步cDNA模板的定量 250 μg total RNA 0.2 μg poly A+ RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H) 20 ng / μl 10 μg total RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H) 20 ng / μl Real-Time PCR成功的关键因素 Primer（引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （cDNA模板） Endogenous reference gene（内参基因） Reaction volume （反应体积） 内参基因 拟南芥 : actin ubiquitin 烟草: actin ubiquitin 水稻: actin ubiquitin Real-Time PCR成功的关键因素 Primer（引物） No template control (NTC) （非模板对照） cDNA template （cDNA模板） Endogenous reference gene（内参基因） Reaction volume （反应体积） Real-Time PCR reaction F Primer( 5 μM ) 200 nM 2 μl R Primer( 5 μM ) 200 nM 2 μl cDNA ( 20 ng / μl ) 100 ng 5 μl Water 16 μl 2x