REAL-TIMEPCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（３）：９０９４ ? ＲＥＡＬＴＩＭＥＰＣＲ方法测定转基因 小麦中外源基因拷贝数 李淑洁　张正英 （甘肃省农业科学院生物技术研究所　兰州　７３００７０） 摘要　采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ方法检测７株转基因小麦中外源半夏凝集素基因的拷贝 Ⅰ 数。以小麦蜡质基因（ｗｘ０１２）作为内参基因，以未转基因小麦基因组ＤＮＡ为内参基因标准品进 行５倍梯度稀释得到内参基因Ｃ值与起始模板量的相关性标准曲线：ｙ＝－０．２６６７ｘ＋６．９８；以含 Ｔ 半夏凝集素基因（ｐｔａ）的质粒ＤＮＡ为目的基的因标准品同样进行５倍梯度稀释，建立目的基因 Ｃ值与起始模板量的相关性标准曲线：ｙ＝－０．２１１８ｘ＋４．５３。通过 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ Ｔ Ⅰ 分别获得每一样本中目的基因和内参基因的Ｃ值，将 Ｃ值分别代入标准曲线计算该样本中内 Ｔ Ｔ 参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因 植株中的拷贝数。计算结果为：单拷贝的有１株，２个拷贝１株，３拷贝和４拷贝的各有２株，其中 有１株为假阳性植株。 关键词　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ 实时荧光定量ＰＣＲ　Ｃ值　ｐｔａ　ｗｘ０１２　转基因小麦　拷贝数 Ⅰ Ｔ 中图分类号　Ｑ７８ ［１２］ 　　Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ是一种常用的ＤＮＡ定量的分子生物 ２０ｐｇ １０ｎｇ的转基因成分进行有效检测 。同时，与 ≈ 学方法，准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法相比，荧光定量ＰＣＲ技术可对 ＴＤＮＡ 另外，由于 Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测不经过靶片段的ＰＣＲ扩 的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的 ［３］ 增，一般每个电泳通道需要 １０～３０ｇ的ＤＮＡ，在实际 基因重组的检测 。 μ 操作中就需要较大量的植物材料来提取 ＤＮＡ，而转基 　　本研究利用农杆菌介导法获得的转半夏凝集素基因 （ 因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化 Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｐｔａ）的小麦为材料，选择小麦 后一般都比较细弱，不宜大量取样。 特有的单拷贝或２拷贝的蜡质基因（ｗｘ０１２）作为内源参 ［４］ 　　实时荧光定量ＰＣＲ技术是一种新的 ＤＮＡ定量方 照基因进行拷贝数估算 ，通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时荧光定 Ⅰ 法。其定量的基本原理是在ＰＣＲ反应体系中加入非特 量ＰＣＲ法检测转基因植株中ｐｔａ基因的拷贝数。 异性的荧光染料（如ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）或特异性的荧光探