A24.用基因芯片技术检测拉米夫定相关性HBV变异剖析.PDFVIP

A24．用基因芯片技术检测拉米夫定相关性HBV变异 复旦大学附属华山医院传染病科(200040) 张继明尹有宽张清波邬祥惠翁心华 上海博华基因芯片技术有限公司研发郜(200092) 倪晓龙昊海 拉米夫定是新一代核苷类似物，对乙型肝炎病毒具有显著的抑制作用，可迅速降低慢性乙型肝炎病 人血清HBVDNA水平，改善肝脏的组织学。但拉米夫定的长期应用，常因HBVP基因的YMDD基序发 生变异而对其产生耐药性。治疗1年的耐药率为17％一46％，治疗3—4年的耐药率可达67％一75％。 目前对拉米夫定相关的HBV变异的检测方法有多种，各有其局限性，尚未有作者报告用基因芯片技术 检测HBV变异。为了验证基因芯片检测拉米夫定相关性HBV变异的敏感性和特异性，我们采用拉米夫 定耐药位点基因芯片，对∞例慢性乙型肝炎病人的血清标本进行了变异检测，现将结果报告如下。 材料与方法 一、血清标本 血清标本来自于30例慢性乙型肝炎病人，其中20倒长期口服拉米夫定，另外lo例服用一般性保 肝、降酶药物。留取治疗前及以后每次随访的血清标本，一70C保存备用。 二、拉米夫定耐药位点基因芯片 拉米夫定耐药位点基因芯片由上海博华基因芯片技术有限公司提供。基因芯片髑作的简要步骤是： 人工合成针对拉米夫定相关性HBV变异位点的特异性寡核苛酸探针，然后将探针基因、定位基因和阳 性对照基因进行特殊处理，再用GMS417 Arrayer点样仪把这些基因固定于经特殊处理的硅质玻片上，经 水合、紫外交联等后处理后，置一4。C保存备用。芯片矩阵以及耐药毒株位点、野生株位点的分布见图 1略。图中每4行为一个矩阵，用于检测一个相应的变异位点。上海博华基因芯片技术有限公司提供拉 米夫定耐药位点基因芯片共有4个矩阵，故可同时检测4种拉米夫定相关性I-IBV变异位点。左边的3 列为变异位点检测区．右边的2列为定位基因区。 三、HBVP基因区部分序列的PcR扩增及鉴定 P基因的保守区序列，自行设计一对引物。扩增的核苷酸片段，覆盖B区 1．引物设计：根据HBV TfTGTC TGTTGCCCG 引物序列如下：上游引物：5’一GTA CATACTTICCAATCA CCTTC,A A1认一3’(nt997—974)。引物由申友公司合成。 TES(含 2．血清HBVDNA的提取：分别取治疗后12个月、21个月的血清标本100ut。加入300ul 10ram Tri8一Hcl；10mM 清，自然晾干，加人20ul三蒸水溶解。 30秒，56℃30 3．PCR扩增与鉴定：PCR的反应体积为50ul，反应条件是94。C预变性3分钟；94C 秒，72E45秒，循环35次；最后72C7分钟。取PCR产物5u1进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物进行 初步鉴定。 四、HBVDNA的序列测定 DNA为阳性的病例．其阳性的Ⅳm产物经透析纯化后，直 拉米夫定治疗12个月和21个月时HBV 接在全身动测序仪上进行测序，将所得序列与基因库中的HBV参照序列进行比较。同时对部分对照组 HBv DNA阳性的PcR扩增产物进行测序。 ——1．55—— 五、用基因芯片检测拉米夫定相关性HBV变异 心15分钟，倒去上清．加人600ul 75％的无水己醇，13000qm离心10分钟，倒去乙醇后晾干备用。 的核苷酸片段(包括552、528、5483个位点)。这样耐整个PCR产物进行了