实验CAM电泳 凝胶层析.pptVIP

* (CAM电泳) 生物化学与分子生物学系 陈园园 实 验 14 血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 实 验 目 的 掌握CAM电泳的基本原理 学习CAM电泳的操作技术 pI Mr.(kD) pI=4.2 80 pI=4.7 40 pI=4.7 15 pI=4.7 40 pI=6.9 70 pH=8.6 + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - 实 验 原 理 影响电泳的因素 待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状 分子带的电荷量越多、直径越小、形状越尖，则其电泳迁移速度越快。 电场强度 强度过高——产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加。 强度过低——电泳时间增加，蛋白扩散。 缓冲液pH和离子强度 支持介质的筛孔 电渗 醋酸纤维薄膜电泳(CAM电泳) 以乙酸纤维素薄膜作为支持体 缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在缓冲液中 均带负电荷（血清蛋白的pI大多在7.5以下） 带电荷较多、分子量较小的蛋白泳动速度快； 带电荷较少、分子量较大的蛋白泳动速度慢 蛋白名称 ? 等电点(pI) 清蛋白 ?1 ?2 ? 分子量 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.50 156 000-300 000 90 000-150 000 30 000 20 000 69 000 按泳动快慢顺序，由正极到负极依次为清蛋白 ?1- ?2- ?- ?-球蛋白 + – 点样 血清蛋白的性质 实验步骤及注意事项 1 准备工作：装置电泳箱，预处理醋酸纤维素薄膜 2 点样：取出浸于巴比妥溶液中的膜，滤纸轻轻吸干至半干燥状态 →分清光面、毛面，在毛面用铅笔标记 →点样器沾适量新鲜血清，在距膜端 1.5~2cm处垂直点样 （必须点在毛面，点样速度要快） 3 电泳：将膜毛面朝下放入电泳槽，所有膜的点样端位于负极 （注意电泳箱的正负极；保持膜平直，不能下垂） 玻璃片密封，电泳条件 —— 125V，60min 断电后，才能取出膜（注意安全） 4 染色：依次将膜投入染色液（氨基黑）中染色10min（轻轻振晃） 5 漂洗：依次经过三个漂洗液，将膜上的染色液洗净 + 铅笔标记 ，垂直点样 保持膜不下垂 半干燥态 实 验 结 果 1 醋酸纤维素薄膜 2 标记出每条条带的名称 凝胶柱层析分离 血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶 实验13 实 验 目 的 掌握凝胶层析的原理及 葡聚糖凝胶的特性 学习葡聚糖凝胶层析的 基本操作技术 凝 胶 层 析 凝胶层析法是指混合物随流动相，经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶胀成一种柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性颗粒，而且每个颗粒的微结构及筛孔直径均匀一致。 实 验 原 理 大分子物质直径大于凝胶网孔，不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，流程短、流速快，首先流出层析柱 小分子物质直径小于凝胶网孔，能自由出入凝胶网孔，因而流程长、洗脱时间长，最后流出层析柱。 分 子 筛 效 应 *