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实验三 提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定—SDS一、实验目的 1、学习和掌握电泳（PAGE和SDS）的基本原理及电泳技术。 2、熟练掌握SDS有关试剂配制的技术。 3、了解SDS垂直板电泳法的基本原理及操作技术。 二、实验原理 电泳的概念：带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳(electrophoresis，简称EP)。 用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 影响电泳的主要因素 影响泳动速度的因素： （1）颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。 （2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。 （3）pH值：对蛋白质而言，溶液的pH值离其等电点愈远，其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。 （6）电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。溶液的泳动现象称为电渗。 当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时则降低颗粒的泳动速度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳： 是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 这种凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide，简称 Acr)和交联剂 N， Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(N，Nˊ-methylena bisacrylamide，简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和 Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时，它们就聚合。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种， 化学聚合和光聚合。 化学聚合： 引发剂是过硫酸铵[(NH4)2S2O3](简称Ap)， 催化剂是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)。 在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。 TEMED在低 pH时失效，会使聚合作用延迟。 冷却（低温）也可使聚合速度变慢。 一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。 这些因素在实际操作时都应予以控制。 光聚合： 以光敏感物核黄素(即VB2)作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。 光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。 采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。 聚丙烯酰胺的基本结构 为丙烯酰胺单位构成的长链， 链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性能。 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。 此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。 凝胶浓度： 用T％表示 每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数。 交联度： 用C％表示 凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数。 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106