第九章原生质体培养及体细胞杂交.pptVIP

细胞工程学  之原生质体培养和体细胞杂交 西华师范大学生命科学学院 生物技术专业08级6班 田东 学号 200811440637 第9章 原生质体培养与 体细胞杂交 本章教学目的与要求 (1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握体细胞杂交融合的方法。 原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 9.1、原生质体分离及纯化 9.1.1、原生质体分离 选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系——叶肉组织细胞 9.1.1.2 材料的预处理 （1 ）暗处理 （2） 预培养 （3） 预萎焉 （4） 预质壁分离 9.1.1.3分离方法 （1）机械分离法 优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大 （2）酶液的配制 （3）分离原生质体 a 两步分离法（先用果胶酶使细胞分离，后用纤维素酶解离细胞壁） b 一步分离法（同时用果胶酶和纤维素酶按一定比例使用） 材料和酶的比例为1：10 温度常用25~30℃ 9.1.2原生质体纯化与活力测定 1、 离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 方法： 原生质体溶液过滤，离心，吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀，如此2-3次。原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 方法： 过滤，离心。吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀，2-3次。收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。 1、形态特征：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、活体染色 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 9.2 原生质体培养 9.2.1培养基 原生质体培养基成分和培养细胞的培养基成分相似 3 有机成分（有利于细胞分裂如km8p。不同的植物需要不同，需严格控制） 4 植物生长物质（对细胞壁的生长，细胞分裂启动，愈伤组织形成植物再生都非常重要。如2，4D） 9.2.2 培养方法 （一)液体培养 1，液体浅层培养 。操作简单，对原生质体损害小；缺点原生质体分布不均匀 2，微滴培养 。在浅层培养发展而来。 （二）固体培养—琼脂糖包埋 和单细胞培养的平板培养法类似 优点 ： 可以提高原生质体的植板率 缺点： 对操作要求严格 混合式温度必须合适—太高对原生质体生命活力造成危害，太低培养基凝固较快，原生质体分布不均一。 (三)液体-固体结合培养 （1）双层培养，培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。 （2）琼脂糖珠培养，将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于培养皿，待其固化后向其中添加液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 （三）饲喂层培养 方法一，X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。 方法二：X-射线杀死原生质体，与琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与琼脂混合，培养于饲养层上 9.2.3 原生质体的再生培养 原生质体再生过程是指原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，先形成新的细胞壁，然后再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或胚状体获得再生植株的过程。。 过程示意图： 细胞壁再生 ↓愈伤组织形成 ↓植株再生 细胞壁再生 体积膨大,叶绿体重新排列,新的细胞壁开始形成,细胞由球形变成椭圆形。 再生能力和速度与供体植物的种类和其体细胞的分化程度及生理状态有关。分生组织分生能力最强。 细胞分裂和愈伤组织形成 原生质体再生出完整细胞壁后，才能进入细胞分裂阶段，当那些可持续分裂的细胞形成小的细胞团史，一般应将它们转接至无渗透稳定剂的培养基中进行培养。 再生出壁的细胞并不一定都能进行有丝分裂。