感受态细胞和质粒dna的转化2.pptVIP

感受态细胞和质粒DNA的转化 陈 溥 言 南 京 农 业 大 学 大肠杆菌(Escherichia coli) 大肠杆菌(Escherichia coli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和期)，约1×109 ~2×108/mL和衰老期。 rpsL (ribosomal protein small subunit) 由30S核糖体蛋白变异而获得链霉素 (Steptomycine)抗性 (Strr)。 gyrA (gyrase) 由DNA回旋酶亚基A的变异而获得的萘啶酮酸(Nalidxic acid) 抗性 (Nalr)。 Tn5 (transposon) 转座子变异，获得卡那霉素 (Kanamycine) 抗性(Kmr)。 Tn10 (transposon) 转座子变异，获得四环素（Tetracycline）抗性（Tetr）。 抗药性的变异 lon (long form) 分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌B株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。 omp (outer membrane protein) 外膜蛋白 膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分解。 宿主蛋白酶缺失 lac Iq (lactose) 乳糖操纵子中控制β-半乳糖苷酶表达的调节蛋白基因。由于lacIq变异，表达调节蛋白过量形成，因此从乳糖启动子开始的转录过程完全受到抑制。 lacZ (lactose) β-半乳糖苷酶活性缺失 lacZ △M15 β-半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表达。当与多数载体质粒中所具有的α-fragment共同存在时，可使β-半乳糖苷酶的活性回复 (α-互补性)。在含有X-gal的平板培养基上，可以通过蓝白菌的差别选择重组体。 deoR deoR变异，可以选择性地改善大分子DNA的转化。 有利于选择转化体的基因 * * * * 导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法 重组DNA导入哺乳动物细胞: DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法 酵母菌转化法: 完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法 细胞的感受态 重组DNA的转化主要取决于细胞的感受态。所谓感受态是指细胞吸收转化因子（重组DNA）的状态。细胞的感受态主要依靠人工处理而获得，如各种前述处理方法，这时细胞可产生感受态因子，从而具有吸收周围环境中DNA的能力。只有经过这些特殊处理的细胞，才具有吸收外源DNA的能力，这种细胞叫做感受态细胞。 细胞的感受态只存在短暂的时间，一般1-2天，新鲜幼嫩的细胞培养物是制备良好感受态细胞、提高转化率的关键。制备或感受态的最佳时间是在生长对数期后期，就E.coli而言，一般培养2-3小时，OD600为0.2-0.5为宜。有些细胞的感受态在加15%甘油后在-70℃以下，可长期维持，用时溶化、混匀即可。 大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。 所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。 2. 菌株的保存 ① LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。 E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中，4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。 ② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。 ③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20～ -70℃。可经过30次冻融，细菌仍然存活。 菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。 具体保存方法： dH2O 甘油 KH2PO4 (NH4)