实验3重组质粒dna提取及双酶切鉴定.pptVIP

左下角处有超级链接到配伍末端 1. 质粒DNA提取 2. 限制性内切酶切割重组质粒 实验三 实验目的 掌握质粒提纯的原理和方法; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶. 预习：基因克隆示意图 基因克隆操作过程： 分 分离载体和目的基因 切 限制酶切载体与目的基因 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 基因载体（gene vector） ＊什么是基因载体 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 ＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件 基因载体应具备特点 1.具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增 2.作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因（表达能力） 3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量） * 基因载体类型 质粒(plasmid) 粘粒（cosmid） 噬菌体(phage) 病毒(virus)DNA 染色体（BAC/YAC） * 一.质粒DNA的制备 1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？ * (1)质粒的定义 质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋(supercoil)形式存在。 * ① 超螺旋DNA(SC DNA) (2)质粒的三种构型 * ② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。 * ③ 线状DNA(linear DNA,L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） * (3)质粒DNA的一般特性： ①质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 * (4)提取质粒DNA的目的与意义（？） 基因载体/基因克隆/基因工程 2 提取质粒DNA的常规方法: 2.1 核酸分离纯化的总原则： ? 保证核酸一级结构完整 ? 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等） 3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤 ①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解 收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。 3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA 3.1 实验原理： ①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA断裂成不同长度的双链DNA。 * ②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离； ③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。 * ④如果要提高DNA的纯度，则可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质。 * 3.2 主要试剂及作用 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） * 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） * 溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕并使质粒DNA复性