实验一血清蛋白质测定范玉平2.pptVIP

方法学介绍 蛋白质测定方法很多，常用的有： 化学法 物理法 染料结合法等 一.化学法 １．凯氏定氮法：用于测定生物物质中总氮含量的方法，其准确度高、精密度好，成为测定蛋白质的最经典的标准方法，但由于其测定手续繁琐，操作复杂，费时，除用作血清蛋白质标准品定值及参考性测定工作外，现已很少在血清总蛋白测定中使用，不适合血清TP的常规测定。 一.化学法 ２．酚试剂法：灵敏度较高，可用于测定脑脊液和尿液中的微量蛋白质，但由于该法是先测定出酪氨酸的量，再根据酪氨酸在蛋白质中含量而得出蛋白质的含量，因而准确度较差。 一.化学法 ３．双缩脲法：测定蛋白质最古老的方法之一，此反应的优点是对白、球蛋白产生的颜色反应相近，干扰物质小，且不受温度影响，唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2～1.7g/L，这相当于70g/L的血清3～24μl，已能满足临床生化检验的需要，成为临床实验室血清TP首选的最方便，实用的常规方法。 二 物理法： 又可分为紫外吸收法、折射法和重量法等。除紫外吸收法外，其他方法现已很少使用或被淘汰。 三 蛋白质与染料结合的方法 是比较灵敏而特异的一类方法。用的较多的染料有丽春红、考马斯亮蓝G250和邻苯三酚红钼。丽春红蛋白结合法测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳定24小时；考马斯亮蓝G250结合蛋白法灵敏度高，特异性强，操作简便，广泛用于尿蛋白，脑脊液蛋白及各种微量蛋白的检测，但该方法测定蛋白浓度的线性范围不宽，与白、球蛋白反应的灵敏度不同，反应强度亦受温度的影响，且比色杯吸附色素而干扰测定，不能用于自动化分析仪，因此该法的应用受到了一定的限制；邻苯三酚红钼络合显色法克服了考马斯亮蓝G250结合蛋白法的上述缺点，且具有简便、稳定等优点，可用于自动化分析仪。 双缩脲法测定血清总蛋白 【目的与要求】 1.掌握双缩脲法测定血清总蛋白的原理和方法； 2.掌握分光光度计的使用方法和日常维护； 3.熟悉血清总蛋白各种测定方法的原理和优缺点。 操作步骤 1.取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）。 操作步骤 2.按下表操作。 操作步骤 3.混匀，置25℃ 30min或37℃ 10min， 4.在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。 5.手工操作参数：波长540nm，光径1cm；温度：室温（18-26 ℃）；模式：终点法；反应时间：30min，样本量：100ul，试剂量：5ml. 5.计算 血清总蛋白 参考范围  正常成人血清总蛋白参考范围 60～80g/L。长久卧床者约低3--5g/L，60岁以上约低2g/L ，新生儿TP浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1岁后达成人水平。 【注意事项】 1.测定的血清以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混浊的标本也可应用，高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。 【注意事项】 2.胆红素和血红蛋白本身的颜色可引起吸光值增加，造成阳性干扰，但经样品空白校正后可忽略不计。由于血红蛋白本身能与双缩脲试剂反应，产生与血清白蛋白和球蛋白相近的显色效价，故应注意高血红蛋白的影响。 【注意事项】 3. 酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标本空白管来消除。 【注意事项】 4.蛋白质与双缩脲试剂反应生成紫色复合物的吸光度与试剂的组分、pH、反应温度以及蛋白质的性质有关，所以在做蛋白质标化测定时，实验仪器的技术状态和反应条件等都必须严格加以控制。 【注意事项】 5.血清蛋白质的含量一般用g/L表示，因为各种蛋白质的分子量不同，不能用mol/L表示。 注意要点： 1．黄疸血清，溶血，高糖，酚酞等干扰用样本空白来消除。 2．加入显色剂要准确，加入后立即混匀。 3. 本反应是TP的最常用和方便的方法，也便于自动化分析。 4. 其与蛋白质中的肽键成正比关系，与蛋白质的种类及AA的组成无明显关系.　　　　　　　　　　　　 【临床意义】 1血清总蛋白浓度降低 （1）蛋白质合成障碍 （2）蛋白质丢失增加 （3）营养不良或消耗增加 （4）血浆稀释 2血清总蛋白浓度增高 （1）蛋白质合成增加 （2）血浆浓缩 血清白蛋白测定 血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法，但目前国内最常用