三叶黄合剂对小鼠细胞免疫功能影响的实验研究论文.docVIP

　　三叶黄合剂对小鼠细胞免疫功能影响的实验研究论文 运晨霞 余晓玲 吴光 肖健 韦海宏 肖艳芬 黄燕 王坤 【摘要】 目的探讨三叶黄合剂对正常小鼠和免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法用三叶黄合剂给正常小鼠和环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠灌胃，然后用称重法检测小鼠胸腺、脾重量，用中性红比色法检测巨噬细胞活性，用RIA法检测白细胞介素-2（IL-2）含量，用MTT法检测NK细胞活性和T淋巴细胞增殖功能。结果三叶黄合剂对正常小鼠胸腺、脾重量和细胞免疫功能无显著影响，对CTX的免疫抑制作用有显著的抵抗作用，能增加免疫抑制小鼠胸腺和脾的重量，增强巨噬细胞的吞噬作用.freell），4℃冰箱保存，应用时用蒸馏水配成所需浓度。MTT试剂盒：R＆D SYSTEMS产品；ConA（刀豆蛋白A），美国sigma公司产品；RPMI1640，美国GIBCO公司产品；IL-2试剂盒（125I-IL-2RIA），北京北方生物技术研究所产品；环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司产品；YAC-1细胞株：本院药理教研室保存；新生牛血清（NCS）：杭州四季青生物工程材料有限公司提供。 1.3 仪器Multiskan MK3型酶标仪，美国Thermo公司产品；Forma 311型CO2培养箱，美国Thermo公司；FJ-2008P型γ放射免疫计数器，西安国营二六二厂产品；722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品；AE260型电子天平，瑞士Mettler产品，B4i型离心机，美国Thermo公司产品。 2 方法 2.1 动物分组及给药方法实验动物随机分为12组，每组10只（其中6组用于检测胸腺、脾重量和巨噬细胞吞噬功能，6组用于检测其它指标）。第1组为对照组，用生理盐水灌胃，每鼠0.4 ml·d-1；第2组为药物对照组，每鼠用三叶黄合剂10 g·kg-1·d-1灌胃；第3组为模型组，用生理盐水灌胃，每鼠0.4 ml·d-1，于实验的第3，5，7天使用CTX 60 mg·kg-1·d-1，i.p造模；第4组为低剂量组，每鼠用三叶黄合剂5 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同，共10 d；第5组为中剂量组，每鼠用三叶黄合剂10 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同；第6组为高剂量组，每鼠用三叶黄合剂20 g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法与第3组同。给药10 d，末次给药后24 h内检测指标。 2.2 免疫器官重量测定［2］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，吸取腹腔液后，解剖小鼠取出胸腺和脾脏，于电子天平上称重。免疫器官系数＝免疫器官重量(mg)∕10 g体重。 2.3 巨噬细胞活性测定［3］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，腹腔内注入5 ml冷Hank液，轻揉腹部数分钟后剖腹，无菌吸取腹腔液，装入含肝素的离心管中，2 000 r·min-1离心10 min，吸弃上清液，再用10％NCS-RPMI1640液5 ml重悬，共2次，调整细胞数为5×106个/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔100 μl，每个样品做3个复孔，37℃，5%CO2培养箱中孵育4 h使巨噬细胞贴壁。然后用10％NCS-RPMI1640液洗3次，每孔加0.072%中性红100 μl，37℃、5%CO2继续培养4 h。用PBS（pH 7.4）洗3次。每孔加脱色剂（V/V：无水乙醇／冰醋酸1∶1）100 μl，室温放置1 h后振荡混匀，用酶标仪于A530 nm处测OD值。结果以3个复孔的±s表示。 2.4 血清(IL-2)含量测定末次给药后2 h摘眼球取血，室温下放置1 h，3 000 r·min-1离心10 min分离血清，用125I-IL-2RIA测定血清IL-2含量。有关操作方法按试剂盒说明书进行。 2.5 NK细胞活性测定(MTT法)［4］末次给药后5 h脱颈椎处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备成脾细胞悬液备用。将脾细胞配成1×106／ml细胞悬液作为效应细胞，取对数生长期的YAC-1细胞配成1×105／ml悬液作为靶细胞，效、靶细胞各取100 μl（效靶细胞的比例为10∶1）至96孔培养板中，每个样品做3个复孔，同时设不加靶细胞的效应细胞对照孔和不加效应细胞的靶细胞对照孔各3孔，置37℃、5 % CO2、相对湿度为100％培养箱中培养4 h，每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），再培养4 h，离心，弃上清，用PBS洗1次以除去效应细胞和被杀伤而脱落下来的靶细胞, 加入30％DMSO 100 μl，振荡后静置20 min, 用酶标仪于波长A570 nm处测OD值, 结果以3个复孔的±s表示NK细胞活性。计算方法为：NK细胞活性（％）= ［1－实验孔OD值－效应细胞孔OD值］/靶细胞孔OD值%×100%。 2.6 T淋巴细胞增殖反应测定(MTT