westernblot总结前人的经验分析.pptx

Western blot; 实验的原理;实验室所用的试剂的配方参考TAKARA分子实验常用配方手册;蛋白样品的制备 SDS 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 ;蛋白样品的制备;3 .对于悬浮细胞，2500g离心5min收集细胞，用 PBS、生理盐水或无血清培养液漂洗细胞，2500g离心5min收集细胞,加入适量裂解液. （约为细胞体积的 5-7 倍）。用移液器吹打数下，把细胞吹散，冰上孵育20min，14000g 离心 10 分钟，取上清，即为 蛋白提取物。 对于组织样品： 1.手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组 织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入匀浆器中。 2.取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1x。 3.按组织净重（g）：裂解液(ml)=1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆(如果裂解 不充分可以适当添加更多的裂解液, 如果需要高浓度的蛋白样品, 可以适当减少裂解液的 用量) 。 4.匀浆器匀浆,冰上孵育 20min，直至充分裂解。 5.充分裂解后, 14000g 离心 10 分钟,取上清,即为蛋白提;蛋白浓度的测定; (5) 加样品：加 2μl 样品到 96 孔板的样品孔中，加 18μl PBS(好用 1%SDS 或裂解液，保 持与原样本中的一致)，使总体积达到 20μl。 (6) 加工作液：每孔加入 200μl 步骤 2 所配制工作液。 (7) 37℃静置 20-30 分钟。可室温放置 2 小时。 (8) 酶标仪测定 A562，540-595nm 之间的波长也可接受。 (9) EXCEL 绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。 附 ; SDS－PAGE 电泳 ;【SDS基本原理】;SDS：;蛋白质-SDS胶束的特点：;SDS凝胶的有效分离范围; SDS－PAGE 电泳详细过程;灌制分离胶 隔绝空气;4、 按前面方法配 5％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空 间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以 免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收 缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经 常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。 5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向 外。） 6、 测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样 品至 PCR管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（5×SDS 上样缓冲液事先跟巯基乙醇按1ml加50ul配好。）上样前要将样 品于沸水中煮 5min 使蛋白变性;灌制积层胶 插入梳子 ;7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。） 用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将移液枪的枪头插 至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品溢出），没加一个样品要换一次枪头 （3） 电泳 电泳时间一般 1.5h，电压为 浓缩胶80V 较好，分离胶120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止 电泳，进行转膜。;; 转膜 ;（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作 在转移液中进行，要不断的擀去气泡。;（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 恒流300mA,转2h （6） 转完后将膜用 1×丽春红染液染 5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染 上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。(此步可以省略) ; 免疫反应 ; 化学发光，显影，定影;（2） 在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X－光片， 用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开 X-光片夹，把 X－ 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片