1-细胞总RNA提取及逆转录.ppt

* 分子生物学实验 1、 每组同学做一份实验； 2、 遵守实验室规则，穿白衣； 3、 同学们在听课时要作好记录; 4、 上课时间。 ～欢迎大家参加分生实验课的学习！ 本学期实验课占总成绩的比例由去年的15%提高到了30%！ 每次实验课为10分。具体包括： 平时表现：2分。包括实验操作规范性、仪器设备使用、学习态度、课堂上回答问题、出勤率等。 实验报告：4分。包括本次实验的原理及大体流程、实验结果、结果分析。 3. 随堂测试：4分。每次课布置1~2个思考题（每个实验室的思考题内容是一致的）。学生在实验报告的最后进行回答。 考试形式 交作业时间：最后一次实验课。学生交卷后签名。 教师按学号排卷，每名同学的3个实验报告放在一起。 缺实验课成绩者，本课程不予通过。 1. 加样器 2. 离心机 先介绍本轮实验中两种常用仪器的使用方法 3、 根据取样量，选择合适量程的加样器。 顶部标记加样器的最大量程，分别为： 20 ? l: 0.5 ~ 20 ?l 100 ? l: 20 ~ 100 ?l 1000 ? l: 200 ~ 1000 ?l ?一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 —— 微量吸取液体 2、 每组3支加样器 Q：如果要吸取5μl、50μl、150μl、 500μl的液体，应选择哪个加样器? 练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少? 4、如何调节？ (1)首先观察目前的读数,假设为050: 最大量程为20?l的加样器 — 5?l 最大量程为100?l的加样器 — 50?l 最大量程为1000?l的加样器 — 500?l (2) 顺时针调节--- 读数变小 逆时针调节--- 读数变大 (3) 注意：调节前，加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。 5、加样器使用步骤： 1）选择加样器,观察读数,调节读数。 安装吸头要紧密(不要用手直接拿吸头)，安装后旋转固定一下。 2）在液面外，先按到第一挡。 3）将吸头插入液面下的适当深度: 过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 4）缓慢松开拇指,吸取液体。 完全放开拇指后，停留半秒钟。急于离开液面，易吸入空气。 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去 6）贴容器内壁，加样器推到第二挡将液体匀速打出。(吸头内有液体时，不能将加样器平放或倒置，液体会倒流损坏加样器！) 7) 观察吸头内液体是否完全打出，将吸头弃于废物盒内。 第一挡为实际读数体积， 第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。 3、将样品标记好并配平, 对称放入离心机（管的连接处朝外）。 4、设定离心的转速和时间。 5、统一离心。 Team Work 二、离心机的使用及注意事项 实验一、 细胞总RNA的提取及逆转录 实验内容： 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳 3、以总RNA为模板的逆转录反应 一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt 第一步： 提取小鼠肝脏组织的RNA 二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染