讲稿第24章重组dna技术20116.ppt

个体克隆：克隆羊多利的诞生 目的基因获取的方法： 1. 化学合成法 2. 基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5. 通过杂交系统获取某些转录因子的编码DNA 酵母双杂交系统原理 真核基因转录因子常含有两个相对独立的结构域，即DNA结构域（BD）和转录激活结构域（AD），其转录活性激活作用需要这两个结构域共同完成。酵母双杂交系统使可能存在相互作用的A蛋白和B蛋白分别与BD 或AD形成杂合蛋白，在酵母中表达， A蛋白如果与B蛋白之间存在相互作用，就可以将 BD 和AD在空间上拉近，连接为一个整体与报告基因上游序列结合，发挥转录激活作用，使受调控的报告基因得到表达。而报告基因表达的产物可以通过其催化的反应被观察。 pBR322质粒的结构 ?噬菌体感染大肠杆菌的途径 噬菌体是感染细菌的病毒， λ噬菌体进入细菌体后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌的染色体一起复制（溶原性）。 另一类是噬菌体进入细菌体后，连续增殖，直到细菌裂解。释放出的噬菌体再感染其它细菌（溶菌性） 。 以?噬菌体为载体进行DNA克隆 Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于PCR。该酶具有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，但没有3′→5′外切酶活性，因而无3′→5′校对活性，故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能。针对此不足，目前研发出多种高保真耐高温DNA聚合酶，大大降低了PCR过程中的碱基错配率。 另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸残基（A）。这样的PCR产物可直接与带有3′-T的线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。 常用的是T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA和RNA的5′-羟基转移。 该酶常用于：① DNA或RNA的5′末端标记；② 使没有5′-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。 应用：一般用于小分子肽类基因的合成 cDNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA片段的集合 * 7版教材图21-9，492页 利用重组DNA技术生产有应用价值的药物是当今医药发展的一个重要方向，其有望成为21世纪的支柱产业之一 该技术一方面可用于改造传统的制药工业，例如，使用该技术可改造制药所需要的工程菌种或创建新的工程菌种，从而提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量 另一方面就是利用该技术生产有药用价值的蛋白质/多肽与疫苗等产品。目前经该技术发展的蛋白质/多肽类药物与疫苗已逾百种 部分经重组DNA技术制备的蛋白质/多肽类药物与疫苗 产 品 名 称 主 要 功 能 组织纤溶酶原激活剂 抗凝、溶解血栓 凝血因子Ⅷ、Ⅸ 促进凝血、治疗血友病 粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 促进红细胞生成，治疗贫血 多种生长因子 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 多种干扰素 抗病毒、抗肿瘤、免疫调节 多种白细胞介素 免疫调节、调节造血 肿瘤坏死因子 杀伤肿瘤细胞、免疫调节、参与炎症 骨形态形成蛋白 修复骨缺损、促进骨折愈合 超氧化物歧化酶 清除自由基、抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断、肿瘤靶向治疗 乙肝疫苗 预防乙肝 口服重组B亚单位霍乱菌苗 预防霍乱 一、重组DNA技术广泛应用于发展蛋白质/多肽类药物与疫苗 二、重组DNA技术应用于真核细胞转基因和基因打靶 （一）利用重组DNA技术可获得转基因动物 转基因动物技术是指将外源基因导入到动物的组织细胞内，并使导入的基因通过遗传传给子代 转基因动物的制备步骤主要包括基因表达载体的构建、转基因动物的建立和鉴定、转基因动物品系的繁育 目前，转基因技术已成功用于建立多种人类疾病的动物模型（如肿瘤、糖尿病、高血压、关节炎等模型）、制备生产药用蛋白的转基因动物，即生物反应器（如可生产凝血因子Ⅸ的转基因绵羊等）、改良动物品种、基因治疗和器官移植研究等 在转基因动物中，以转基因小鼠（transgenic mouse）最为常见 建立转基因小鼠的常用方法 直接将目的DNA显微注射到受精卵的雄性原核，然后植入假孕母鼠体内，使之发育成幼仔 将带有目的基因的胚胎干细胞注射到囊胚，然后在小鼠体内发育成幼仔 制备转基因小鼠和小鼠基因打靶的基本过程 （二）重组DNA技术可用于基因打靶 基因