超好研究生分子生物学课件-第六章基因工程.pptVIP

pBR322图谱 2、pUC系列载体 pUC系列载体是在pBR322质粒载体的基础上改建而成的 ，保留了pBR322的一部分，插入了一个来自M13噬菌体并带有一段MCS的LacZ′基因，而发展为具有双重检测特性的质粒载体。 质粒pUC系列图谱 3、穿梭质粒载体 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 4、TA克隆载体 专为克隆PCR产物而设计的，它们的共同点是在其多克隆位点两侧的3′末端携带有未配对的T碱基，多克隆位点均位于?半乳糖苷酶的?肽编码区内并且都含有T7启动子 pBS-T载体图谱 pGM-T载体图谱 pCF-T载体图谱 5、噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，phage）是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。 主要有λ噬菌体和M13噬菌体 M13噬菌体 6、酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC） YAC主要包括以下调控元件： ①着丝粒（centromere，CEN） ②端粒（telomere，TEL） ③复制起始点和限制性酶切位点 ④选择标记 ⑤原核序列及调控元件 YAC结构及其基因重组过程 细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome vector，BAC） 噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC） 哺乳动物人工染色体（MAC） 7、逆转录病毒载体 逆转录病毒为单正链RNA病毒，可高效感染许多类型的宿主细胞，并稳定整合到宿主细胞染色体上，是最先被改造且应用最为广泛的病毒基因载体。 构建的逆转录病毒载体主要有两类: 卸甲载体（disarmed vector） 穿梭载体 8、腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒 ,基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（inverted terminal repeat，ITR），为病毒复制和包装所必需 基因组组成：早期转录区 晚期转录区 RNA聚合酶Ⅲ转录子 （二）表达载体（expressing vector） 表达载体是在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列 原核表达系统 真核表达系统 1．大肠杆菌表达载体 启动子(promoter) 核糖体结合位点（RBS） 转录终止信号 表达元件 pRSET载体 pIN-ompA载体 2．真核表达载体 质粒载体(plasmid vector) 病毒载体(viral vector) 常用的病毒载体： 腺病毒载体 逆转录病毒载体 SV40 腺相关病毒载体 pcDNA3.1载体 第三节 基因克隆的基本过程 基因克隆过程主要包括： ①目的基因的获取 ②基因载体的选择与构建 ③基因载体与目的基因的连接 ④DNA重组体导入受体细胞 ⑤含DNA重组体细胞（转化子）或菌 落的筛选与鉴定 载体 目的基因 重组DNA分子 细菌 转化或转染 扩增 筛选阳性克隆 基因克隆的基本过程 一、目的基因的获取 (一) 直接从基因组DNA中分离 (二) 化学合成法 (三) 逆转录法 (四) 聚合酶链反应 (五) 从基因文库中筛选获得 二、基因载体的选择与制备 ①必须具有自主复制能力，拷贝数高，易与宿主细胞染色体DNA分离 ②分子量小，易进行操作，并能容纳较大的外源DNA分子； ③与宿主细胞具有两个或多个易于筛选的标记 ④有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点 三、DNA重组体的构建 目的基因与载体的连接与自然界发生的基因重组不同,其本质上是一个酶促反应过程，即在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子（目的基因）与载体DNA分子连接成一个重组DNA分子（DNA重组体）的过程 * * 第六章 基因工程 genetic engineering 生物技术工程（biotechnology engineering) 基因工程 蛋白质工程 酶工程 细胞工程 第一节 基因工程的基本原理 一、基因工程技术的诞生及意义 二、基因工程技术的基本原理 克隆（clone）指的是来自于同一始祖的相同分子、细胞、细菌或动物群体 重组DNA（recombinant DNA）, 用酶学方法，在体外将各种不同来源的DNA与载体DNA连接成能自主复制的重组DNA