第五章xin电泳技术.pptVIP

基本原理 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可 使它们分离。 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q 在溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6πrηV 当F引=F阻时 EQ= 6πrηV V = EQ/6πrη 由上式可以看出，粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比，而与粒子的半径(r)及溶液的粘度(η艾塔 )成反比。 大分子样品的性质 电场强度 溶液的pH 离子强度 支持介质的筛孔 （5）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，以保存；吸附力要小，无电渗作用。样品电泳的过程，实际上就是在支持介质中运动的过程，所以有直接影响。可以表现为吸附作用、电渗作用及分子筛效应。  ※吸附作用：是介质对样品颗粒的吸引，所以出现拖尾和条带不均匀。纸最大、醋酸纤维素介质最小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶居中。 ※分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 ※电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。（以纸为例） （8）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉电泳、连续纸电泳、电泳－层析相结合技术等。 （9）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、血清蛋白电泳、制备电泳、DNA测序电泳等。 一、琼脂糖凝胶的特点 优点 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 有热可逆性。 缺点 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 三、电泳具体操作 1. 凝胶准备 ①根据核酸分大小确定浓度；称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TBE； ② 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖； ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 5μl，并轻轻混匀。 2. 胶床准备 ① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； ② 将胶床放在调整好的水平台上； 3. 铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5mm； 4. 室温下静置半小时左右，凝胶固化，轻轻拔出固定在凝胶中的梳子 。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极； 5. 向电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 6.样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； 7.上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10μl ； 8.盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；电泳条件：电压80v；时间20～25分钟； 9.电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 10.电泳结果分析： ① 紫外检测仪直接观察电泳条带 ② 摄影记录 注意事项 1. 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 2. 因EB存在，全部操作过程要带防护手套； 3. 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 4. 加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。 5.每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。 6. 在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（ 需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。） 目的与意义：掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的 基本操作方法