第五章+分子生物学研究法上.pptVIP

5.2.2 核酸凝胶电泳技术 目的：分离不同的DNA分子 电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。 影响迁移率的因素： （1）与电场强度、电泳分子净电荷成正比； （2）与电泳分子的摩擦系数成反比 分子摩擦系数为分子大小、极性、介质粘度的函数。 DNA和RNA在电场中为多聚阴离子，电泳时向正极移动。速度在于分子大小和构型。 电泳介质：一般用琼脂糖和聚丙烯酰胺，浓度与所分离的DNA和RNA的大小有关。（表） 染色剂：溴乙锭 5.2.3 细菌转化与目标DNA分子的增殖 转化法：将外源DNA导入宿主细胞，以改变细胞遗传性状的过程。或者细菌捕获另一菌株的DNA而发生遗传性状的改变，称为转化；将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞，称为转染，以与病毒的感染相区别。 目的：目的基因导入受体细胞，分子扩增 供体菌株/受体菌株 感受态细胞：能够高效吸收外界DNA的细胞，是一种生理状态，可以人工诱获。 感受态的诱导方法： CaCl2法：0℃ CaCl2低渗，加入外源DNA，42℃热刺激 用氯化钙法使大肠杆菌细胞处于感受态，从而将外源DNA导入细胞，至今仍然是应用最广泛的方法。氯化钙法的作用机制并不完全清楚，可能是在低温下Ca2+ 使质膜变脆，经瞬间加热产生裂隙，外源DNA得以进入细胞内。制备感受态细胞的方法已有了不少改进，主要是加入各种金属离子或用还原剂和二甲亚砜处理细胞膜。 电击法：采用脉冲高压电瞬间击穿双脂层细胞膜能使外源DNA高效导入细胞，该方法称为电穿孔法。 转化过程（图） 噬菌体感染法：噬菌体颗粒能将其DNA分子有效注入大肠杆菌细胞内，而与颗粒内所含DNA的来源无关。重组噬菌体载体DNA或柯斯载体DNA，只要片段大小合适，都能与噬菌体外壳蛋白和协助包装的蛋白质一起在体外包装成噬菌体颗粒。将重组体DNA包装成噬菌体颗粒可以大大提高导入宿主细胞的效率，比感受态细胞的转化率提高10~100倍。（图） 　5.2.4 外源基因导入真核细胞 在基因工程研究中，常需将外源基因导入真核细胞，以对目的基因进行改造和表述。常用的基因工程真核细胞包括酵母细胞、动物细胞和植物细胞。 （1）外源基因导入酵母细胞： 在对酵母细胞进行外源DNA转化时，一般先需要用酶将其细胞壁消化水解，变成原生质体。蜗牛消化酶具有纤维素酶、甘露聚糖酶、葡萄糖酸酶以及几丁质酶等，对酵母菌细胞壁有良好水解作用。原生质体在氯化钙和聚乙二醇存在下，重组DNA能容易地被宿主细胞吸收，转化的原生质体悬浮在营养瓶中，即可再生出新的细胞壁。 （2）外源基因导入动物细胞常用的方法有： 磷酸钙共沉淀法。用Ca2＋沉淀磷酸离子和DNA，沉积在细胞膜上的DNA可通过吞噬作用被细胞吸收； DEAE-葡聚糖或聚阳离子，它们能结合DNA并促使细胞吸收； 脂质体法，利用类脂经超声波、机械搅拌等处理，形成内胞DNA溶液的双脂层小囊泡，通过与细胞质膜融合而使DNA进入细胞； 脂质转染法，用人工合成的阳离子类脂与DNA形成复合物，借助类脂穿过质膜而将DNA导入细胞内； 电穿孔法，在脉冲高压电场作用下，质膜瞬间被击穿，使DNA进入细胞，细胞膜随即被修复正常。 显微注射法：对哺乳动物受精卵等较大的细胞，导入外源DNA可采用显微注射法，在显微镜下，用极细的玻璃注射器针头插入细胞内并注入DNA溶液。 （3）外源基因导入植物细胞常用的方法有： 转化法：将外源DNA导入植物细胞，通常需要先用纤维素酶消化细胞壁，制备原生质体，植物细胞的原生质体经聚乙二醇、磷酸钙、氯化钙等化学试剂处理后，即可有效地摄取外源DNA。 电穿孔和脂质体法：电穿孔法和脂质体法也适用于原生质体的转化。 显微注射法：显微注射法可直接将外源DNA注入细胞内，而无需制备原生质体。 农杆菌感染法：根瘤农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA ，又称转移DNA，能携带外源基因转移到植物细胞内，并整合到染色体DNA中，因此Ti质粒是目前植物基因工程中最常用的理想的基因载体。 基因枪法：另一有效方法是高速微弹发射装置，又称基因枪。常用直径为1m左右的惰性重金属粉末作为微弹，如钨粉或金粉，其上带有DNA，将微弹置于发射器挡板的凹穴内，当用火药或高压气体发射弹头撞击挡板时，微弹即以极高的速度射向靶目标。 5. 2. 5 聚合酶链式反应（PCR）技术 20世纪80年代凯利.穆利斯（美）发明PCR技术。 （1）目标：将目标DNA片段的数量扩充千百万倍 （2）所需条件： 模板DNA，含有要扩充的片段； 一定浓度的引物，含要扩充的片段两端的引物； 在高温下还有活性DNA聚合酶（Tac酶）； 四种核苷酸，Mg2+ 离子； PCR仪。 （3）技术要点： 加温使模板DNA变性成为单链 适当降温（退火），使引物与模板DNA结合； Tac酶作用下合成DNA（延伸）； 再变性；