第五章分子生物学研究法--dna、rna及蛋白质操作技术.pptVIP

第五章 分子生物学研究法(上) ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR引物设计 一对引物，与3′端互补 长度：15～30个核苷酸 碱基分布随机 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 3′端必须互补 5′端可游离 逆转录过程中cDNA的合成 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，?即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析； 比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。 总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。 基因文库从功能上可分为：克隆文库及表达文库。 ①克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。 ②表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。如某抗原蛋白。 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA。 反转录由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligo dT（寡核苷酸dT），包含12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物（通常为XhoⅠ等酶切位点）以便于克隆构建。 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。 cDNA合成中的分子修饰。 在cDNA合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP； cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链cDNA的方向性。 甲基化dCTP是为了保证cDNA链被甲基化修饰，防止构建克隆时被限制性内切酶切割。 第二链cDNA的合成由DNA聚合酶催化： 常用RNaseH切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成第二条cDNA片段，再通过连接酶连成完整的DNA链。 加入另一个酶切位点的粘性接头（EcoRI），与cDNA相连接后用XhoI酶切，使cDNA双链两端分别具有EcoRI和XhoI粘性末端，保证它与载体相连时有方向性 5.3.4 cDNA文库（cDNA Library）的构建 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，仅有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 由于cDNA的长度一般在0.5-8Kb，常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。 cDNA文库载体选择一般根据文库的用途来确定。 如：常用的Uni-zapXR载体是一种λ噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10kbDNA插入片段。 该载体内部含有pBluescript载体的全部序列，重组后可通过体内剪切反应将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。 cDNA文库载体的选择 含有cDNA插入片段的重组噬菌体只有经过体外蛋白质外壳包装反应，才能成为有侵染和复制能力的成熟的噬菌体。 包装反应的实验条件要求非常精准，DNA和蛋白质提取物浓度、两者的体积比、反应温度及时间等对包装都有很大的影响。 重组噬菌体如何变得有侵染和复制能力？ 基因文库的筛选：指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。 1、核酸杂交法 基因文库筛选最常用的方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选； 2、PCR筛选法 操作简便。但前提必须已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。 3、免疫筛选法 基于抗原抗体特异性结合原理，适用于对表达文库的筛选。 5.3.5基因文库的筛选 将一张圆形硝酸纤维素膜放在一个装有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板做对照。 取出已