第二章常用实验方法mzw2016.pptVIP

对标本的纯度要求低 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 四、PCR基本操作 四、PCR基本操作 1.加样 (1)向一微量eppendorf离心管（壁薄、管底扁平、深度适宜）中依次加入：5 x PCR buffer、ddH2O、dNTPs、Primers；102-105个copy 的DNA样品；Taq DNA聚合酶0.5μl （混匀后,离心）；加入石蜡油。 2.上机：设置循环程序，进行扩增。 3.PCR产物电泳：凝胶的制备；点样与电泳；观察结果；作好记录或摄影，保存好实验结果。 PCR 反应体系与流程 反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP 反应流程 预变性 变性 退火 延伸 延伸完全 终止 25～35循环 PCR Agarose gel electrophoresis The final product UV visualisation 3-4 hours PCR产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 常用于临床检测（定性） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析 五、PCR技术的应用  1. RT-PCR 　　　 RT-PCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 /video/66-233-1.html 2. 实时定量PCR 3. 高通量测序技术 　　 RT— PCR 逆转录酶 DNA聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 1971年， Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）： 经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 故事发生在1983年的春夏之交 Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， …… 第一个PCR实验 1983年9月， Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后37 ℃保温，结果失败。 长时间的反复改进，1984年11月，PCR实验成功。 1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 PCR技术简史 1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。 PCR技术简史 二、 PCR技术原理 DNA体外的快速扩增技术 试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 变性--退火--延伸 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝