第二章基因工程的酶学基础2006.ppt

回 顾 抗生物素蛋白（avidin）： 链霉抗生物素蛋白（streptavidin）： 生物素的识别——亲和素： 是一种鸡卵清蛋白。 细菌中avidin的类似物。 能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用： ii）地高辛标记： 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。 生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。 地高辛的结合物是抗地高辛抗体。 iii）偶联酶及其底物 常用的两种酶： 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP） 催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。 酶的作用： 4. T7 DNA聚合酶 （1）来源 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： ① T7基因5编码的大亚基： 有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。 ② 大肠杆菌编码的小亚基： 硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。 3.2. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 连接酶反应的最佳温度是37?C。 四、连接反应的温度 1. 最佳温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 2. 实用温度 所以一般采用 4~16 ?C。 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 1. 插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度 12.5℃。 五、影响连接反应的因素 10~20倍。 一般14~16℃ 3. 连接酶的浓度 在平末端DNA的连接反应中,最适的反应酶用量为1~2U,而黏性末端仅为0.1U便能达到连接的最佳效果. 4. 连接反应的时间 当连接温度在12~16 ℃之间时,连接反应时间在1~16小时之间.如果温度更低,则延长反应时间. ? 由限制性内切酶创造的黏性末端的连接属于分子内部的连接,而平齐末端的连接则属于分子之间的连接,因此后者反应速度相对慢得很多,如何提高其连接效率呢? 1、加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接） 2、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 3、加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用 4、加入单价阳离子（Nacl )，最终浓度150~200 mM 5、将平齐末端变成黏性末端 第三节 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 二、常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 高 快 有 无 Taq DNA聚合酶 中 低 无 无 逆转录酶 高 快 无 无 遗传修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 低 化学修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 高 T7DNA聚合酶 低 中 无 高 T4DNA聚合酶 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 有 低 大肠杆菌DNA聚合酶 持续能力 聚合速率 5’?3’外切酶活性 3’?5’外切酶活性 DNA聚合酶 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 ①一条单链多肽 ②具有5’?3’外切酶活性 3’?5’外切酶活性 5’?3聚合酶活性 ③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 ① 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’—OH游离端的引物 ④ DNA模板 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 -OH 5’ 3’ dNTPs 可以是单链的，也可以是双链的 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH DNA pol I 5‘ ppp dN Mg 2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）的聚合图 标记 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。 （3）DNA聚合酶I的用途