第二章基因操作的主要技术原理2.pptVIP

用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。 步骤： 性母细胞,同时用生物素标记的重复DNA序列(用荧光素\绿色荧光检测) 和地高辛标记的端粒特异的重复序列(用罗丹明\红色荧光检测) 用三次曝光（罗丹明、荧光素和DAPI滤光镜） GO 六、蛋白质/核酸杂交技术 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。(聚丙烯酰胺凝胶电泳) 它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。 1. 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 2、DNaseⅠ足迹实验（footprinting assay） 32p 1 5 10 * 1 4 8 10 * 加入蛋白质X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A B 足迹 (a) (c) (b) DNaseI 足迹实验 DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片断上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。 3、硫酸二甲酯（DMS）足迹实验： DNA + DMS Gel Shift + Saturating [Protein] 第四节DNA核苷酸序列分析 一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert化学分析法 三、杂交测序法 四、Shotgun测序 Sanger等1977年发明。 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 一、Sanger双脱氧链终止法 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长。 1.Sanger双脱氧链终止法原理： dNTP/ddNTP=1:100，DNA的谱带分离效果较佳。可读出200个以上的核苷酸顺序。 降低ddNTP与dNTP的比例，就会产生出逐渐加长的片段产物，用聚丙烯酰胺凝胶分离，可读出300个左右的核苷酸顺序。 2.影响因素： 用限制性内切酶把高分子量的DNA分子消化为合适的片断，经电泳分离纯化后，才能用来序列分析。 采用分子克隆的方法，即将酶切消化的片断随机的连接到一种适合的载体上。引物（通用引物）是载体上的一段序列，它能特异性的同载体分子上克隆位点相连的单链DNA区段杂交。 3.通用引物进行测序 Sanger双脱氧-M13体系 M13是噬菌体载体，可以得到单链的DNA序列。 Sanger双脱氧-pUC体系 pUC是一种质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。 用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5’-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来 4.DNA测序分析的自动化 二、Maxam-Gilbert化学分析法 1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。 Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖 1.原理： * * * * * 第一节核酸的凝胶电泳 第二节扩增原理(PCR) 第三节分子杂交 第四节测序