同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR（Arm-PCR）方法的建立和应用.pdfVIP

第 37卷 第 4期 渔 业 科 学 进 展 Vo1-37．NO．4 2016 年 8 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Aug．，2016 DOI：10．11758／yykxjz．20150606001 http：／w／ww．yykxjz．cn／ 同步检测 7种鱼类病毒的扩增子拯救多重 PCR (Arm．PCR) 水 王胜强 ，3 耿伟光 史成银 ，2① 李 晋 粟子丹 (1．农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071； 2．青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071； 3．上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306) 摘要 淋巴囊肿病~(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、 传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒V(HSV)和传染 性鲑鱼贫血症病毒0SAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原，危害巨大。为实现这 7种病原的高通量、同步 检测，本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上，设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物， 并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、PrimerMix浓度及退火温度等参数进行调整和优化，结合基 因芯片检测技术，建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm．PCR方法。优化后的Arm．PCR方法第一步PCR 体系为：Taq酶(2．5U／~d)1．0 l，IOxPCRBuffer(含20mmol／L的Mg)5Ixl，dNTP(各2．5mmol／L)5 l， lOxPrimerMix(各2~mol／L)9 1，模板 1pl，ddH2O补足至50 ，退火温度为56℃。研究结果显示，该 方法可以在 1支反应管内对上述 7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测，检测灵敏度分别为 10 copies#d(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10copies／l~l(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和 10copies／Ixl (大菱鲆红体病虹彩病毒，rRmV)。该方法特异性强，与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA 不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测 7种鱼类病毒的Ann．PCR方法具有高通量、高灵敏度、高 准确性的优势，能有效提高工作效率，在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。 关键词 鱼类病毒；多重检测；高通量；多重PCR 中图分类号 $943 文献标识码 A 文章编号 2095．9869(2016)04．012807 随着社会经济的快速发展，水产养殖业也呈现出 病毒 (Infectiouspancreaticnecrosisvires，IPNV)(Wallace 养殖规模和养殖技术的空前提高，尤其在集约化养殖 etal,2008)、病毒性出血败血症病毒(Viralhemorrhagic 和工厂化养殖方面发展迅速 。但在海水经济鱼类的养 septicemiavires，VHSV)(Isshikietal，2001)和传染性鲑 殖过程中，病毒性疾病 的暴发往往会给养殖业带来巨 鱼贫血症病毒(Infectioussalmonnaaemiavires。ISAV) 大的危害。淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdiseasevirus， (Lyngstadetal，2012；Godoyetal,2013)是养殖鱼类主 LCDV)(徐洪涛等，2000)、肿大细胞病毒属虹彩病毒 要的病毒性病原，它们均能引起传染性、暴发性疾病， (Megalocytivirus，Mega)(Chaoetal,2004)、赤点石斑鱼神 同时伴随着高死亡率，给养殖企业造成严重的经济损 经坏