香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响.docVIP

　　香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响 作者：韦继南,吴小涛,陈晓刚,王斌 【摘要】 目的：观察香豆雌酚对大鼠成骨细胞(OBs)增殖分化的 影响 ，初步探讨香豆雌酚对OBs的作用机制。 方法 ：用不同浓度香豆雌酚干预OBs，根据不同时间分别用酶消化法测碱性磷酸酶活性和羟脯氨酸含量、放免法测骨钙素含量及半定量RTPCR法检测OBs内OPG/RANKL基因的表达。 结果:香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进大鼠OBs增殖及碱性磷酸酶表达;干预12h，各浓度组羟脯氨酸含量呈浓度依赖性增高，其中10-8mol·L-1作用最大(P=0.022)；培养12h，OBs表达骨钙素呈浓度依赖性，24h达高峰，其中10-8mol·L-1有显著性差异(P=0.012)，48h有所下降；不同浓度、时间组香豆雌酚均能促使OBs增加表达OPG mRNA，同时有抑制RANKL mRNA表达的作用，其在24h 10-8mol·L-1浓度作用强度最大(P=0.038)，10-5mol·L-1则呈现抑制作用。结论:香豆雌酚能促进OBs的增殖分化，其作用呈浓度和时间依赖性，且至少部分有OPG/RANKL途径的参与。 【关键词】 香豆雌酚；成骨细胞；护骨素；骨质疏松；大鼠 雌激素在绝经后骨质疏松的发生 发展 中起着十分重要的作用，绝经后雌激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)曾被认为是绝经后骨质疏松 治疗 的金标准，但随着HRT所带来的阴道出血、乳腺癌、子宫内膜癌等风险大大限制了其临床推广 应用 [1]。近年来植物雌激素(phytoestrogen,PE)备受关注，它们的结构类似于17β雌二醇，能预防和治疗绝经后骨质疏松，但对子宫和乳腺无刺激作用[2]。动物实验表明，PE香豆雌酚能减少去卵巢大鼠骨丢失和骨吸收，增加骨密度[3],有 研究 报道香豆雌酚能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及骨吸收活性[4]，但其具体机制尚不清楚，对成骨细胞的作用也未见报道。为观察香豆雌酚对成骨细胞的直接作用，本实验拟用香豆雌酚干预体外培养的新生大鼠成骨细胞，观察其对成骨指标的影响，初步探讨其对骨代谢的作用及其机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 主要材料新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供）,LGDMEM(Gibco BRL),FBS(杭州四季青),ALP染色试剂盒(南京建成生物研究所),骨钙素试剂盒(北京科美东雅公司),TRIzol(Katara Ltd.),RTPCR kit(MBI Ltd.),Ⅰ型胶原酶、胰酶、MTT、DMSO、Coumestrol、Estradiol(Sigma Ltd.USA),其余试剂均为国产 分析 纯。 　　1.2 细胞培养 1.2.1 新生大鼠颅骨成骨细胞培养 参照 2.2 香豆雌酚对成骨细胞增殖和分化的 影响 2.2.1 香豆雌酚对大鼠成骨细胞增殖的影响 MTT结果显示，干预12h各浓度组香豆雌酚能促进成骨细胞增殖，24h作用最强，48h后有所减弱。其中10-9mol·L-1和10-8mol·L-1干预24h时产生显著的促进增殖作用(P=0.02、0.017)，但10-5mol·L-1香豆雌酚对成骨细胞增殖产生抑制作用。 2.2.2 香豆雌酚对大鼠成骨细胞分化的影响 2.2.2.1 香豆雌酚对大鼠成骨细胞内碱性磷酸酶的影响 培养12、24和48h,各浓度香豆雌酚呈时间和浓度依赖性轻度促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达，但无统计学意义。 2.2.2.2 香豆雌酚对大鼠成骨细胞分泌羟脯氨酸的影响 培养12h,各浓度香豆雌酚呈浓度依赖性促进羟脯氨酸分泌,10-8mol·L-1有显著促进作用(P=0.022);培养24和48h后仅有轻度促进作用,无统计学意义(P=0.10)。 2.2.2.3 香豆雌酚对大鼠成骨细胞骨钙素的影响 培养12h，各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加，但无统计学意义(P=0.081)；培养24h，10-8mol·L-1香豆雌酚显著增加成骨细胞内骨钙素表达，有统计学意义(P=0.012)；培养48h，各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加，高浓度(10-5mol·L-1)组出现抑制作用。 2.2.3 香豆雌酚对大鼠成骨细胞OPG基因表达的影响RTPCR 分析 表明，香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进成骨细胞OPG/RANKL基因表达，10-8mol·L-1干预24h显著增加OPGmRNA表达(P=0.015)，抑制RANKL基因表达(P=0.038)，OPG/RANKL显著升高；高浓度(10-5mol·L-1)香豆雌酚对OPG基因表达有抑制作用(Plt;0.05) 　　3 讨论 　　PE分为异黄酮类(isoflavones)、木酚素类(lignans)