靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定.docVIP

　　靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定 【摘要】 目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定。方法 ①根据人类EGFR的mRNA序列，设计4条干扰片段，以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体，构建shRNA重组体，转化入DH5a大肠杆菌，提取质粒，进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞，用G418筛选阳性克隆。结果 ①经酶切及测序鉴定，成功构建了针对 EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞，经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论 利用 RNAi技术原理成功构建针对 EGFR的shRNA重组质粒，并转染入Colo-16细胞。 【关键词】 表皮生长因子受体;RNA干扰;短发卡状RNA;转染 　　Abstract： Objective To establish and identify the plasmid expression vector encoding short hairpin RNA (shRNA) targeting epidermal groan gene. Methods ①Four short hairpin RNAs (shRNA) o sapiens EGFR mRNA ID, and then rebinant shRNA ids as vectors, respectively. The plasmids id extraction and the subsequent identification by enzyme digesting and sequencing. ②Four rebinant plasmids ine 2000 and e-digestion sequencing confirmed that four plasmids containing shRNA ids ids targeting EGFR al groall hairpin RNA; transfection 　　表皮生长因子受体(epidermal groal groRNA结合, 可靶向切断降解此mRNA, 在蛋白翻译前抑制基因表达[5]。我们构建编码EGFR的短发卡状RNA (shRNA) 质粒表达载体,并对其进行鉴定,为皮肤鳞癌的靶向 治疗 寻找新的途径。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 空质粒PGPU6/GFP/Neo为Genepharma公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为美国Promega公司产品。Lipofectamine 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品。感受态菌DH5a购于博大泰克公司;质粒抽提试剂盒购于Promega 公司;G418、卡那霉素购于Sigma公司;人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞由 中国 医学 科学 院皮肤病研究所周武庆教授惠赠;RPMI 1640培养基购于GIBCO公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 EGFR siRNA转录模板DNA链的设计、合成 针对EGFR基因的siRNA寡核苷酸序列设计，通过在GenBank上比对[6]，分别选择EGFR基因(NM 005228)CDs编码序列中的第282～300、63～ 81、402～422、506～526特异性序列为siRNA的正义链，按siRNA设计原则，由Ambion公司设计、合成1#、2#、3#、4# EGFR siRNA 4对，经Blast Search检索确认与EGFR以外的人类已知基因序列无同源性。序列如下： 1#siRNA正义链5′-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3′，反义链 5′-GTGTCACCTCGCTTAAGGA-3′。2#siRNA正义链5′-GAGTCGGGCTCTGGAGGAA-3′; 反义链 5′-CTCAGCCCGAGACCTCCTT-3′。3#siRNA正义链5′-GCTGCCCATGAGAAATTTACA-3′;反义链 5′-CGACGGGTACTCTTTAAATGT-3′。4#siRNA正义链5′-GCAGTGACTTTCTCAGCAACA-3′; 反义链 5′-CGTCACTGAAAGAGTCGTTGT-3′。根据1#siRNA、2#siRNA 、3#siRNA、4#siRNA序列，设计模板DNA链4条，由Invitrogen公司合成。其构建顺序为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop接头序列、反义序列、 RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。将寡核苷酸序列克隆到载体上。 　　1.2.2 表达质粒PGPU6/GFP/Neo-EGFR shRNA的构