靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定.docVIP

　　靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定 【摘要】 目的 通过构建骨桥蛋白(osteopontin，OPN)shRNA表达载体，探索卵巢癌基因 治疗 新途径。方法 根据基因库上的OPN-mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用 T4DNA连接酶连接到线性化的pSilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果 OPNsiRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论 靶向OPN shRNA表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌OPN表达的抗肿瘤效应，及与放化疗的协同效应打下了基础。 【关键词】 骨桥蛋白;shRNA;表达载体;卵巢癌 　　Abstract: Objective To explore the neRNA geic sequence database, an oligonucleotide chain consisting of 64 bases restriction sites at both ends id pSilence e digestion of rebinant plasmid and sequencing.Result The OPNsiRNA express vector cloning otherapy. 　　Key bion公司，该载体含有人H1启动子，包括BamHⅠ及HindⅢ酶切位点。 　　大肠杆菌DH-5α购自碧云天生物有限公司。BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶购自MBI公司，质粒小量提取试剂盒购自TIANGEN生物公司。DNA凝胶回收纯化试剂盒购自Promega公司。 　　1.2 实验室及仪器 本实验在徐州医学院肿瘤生物治疗实验室完成。PCR仪(Eppendorf公司)，高速离心机(Eppendorf公司)，电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂)，摇床(太仓市实验设备厂)。 　　1.3 方法 　　1.3.1 siRNA设计与合成 根据GeneBank收录的骨桥蛋白的基因序列(NM000582)作为分析序列，采用Ambion公司的网上设计软件( .ambion. )， 参考 siRNA设计原则[4]，选择最佳干扰位点，本研究选取的靶位点是：ACAGGCTGATTCTGGAAGT;AGCCAATGATGAGAGCAAT;针对靶位点分别设计两条互补的寡核苷酸序列，寡核苷酸的两端带有与BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点互补的粘端序列，能够直接与经BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切的载体连接。并通过BLAST对所选择的靶序列进行同源分析,排除siRNA非特异性抑制其他基因片段的可能。shRNA序列茎环结构为9个与OPN基因不互补的非同源碱基(TTCAAGACG),末端终止子为TTTTTT 。设计的具有发夹结构的shRNA干扰片段序列如下。结构模式为:BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+HindⅢ。共设计了2对OPN特异性siRNA编码序列,如下： 　　OPN-shRNA1:5′GATCCGACAGGCTGATTCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGAATCAGCCTGT T 　　TTTTTGGAAA-3′; 　　反向互补序列：5′AGCTTTTCCAAAAAAACAGGCTGATTCTGGAAGTTCTCTTGAAACTTCCAGAATC 　　AGCCTGTCG-3′; 　　OPN-shRNA2:5′GATCCGAGCCAATGATGACAGCAATTTCAAGAGAATTGCTGTCATCATTGGCTT 　　TTTTTGGAAA-3′; 　　其反向互补序列:5′-AGCTTTTCCAAAAAAAG 　　CCAATGATGACAGCAATTCTCTTGAAATTGCTGTCATCATTGGCTCG-3′。 　　阴性对照序列:以上寡核苷酸序列单链由上海生工生物工程公司合成。 　　1.3.2 双链寡核苷酸的合成 将合成的单链寡核苷酸溶解于无核酶水中，终浓度为1 g/L。将互补的两条寡核苷酸各取2 μl，加入46 μl的退火缓冲液，置PCR反应仪上，设定反应条件为：90℃ 3 min，37 ℃1 h，得到退火产物。-20℃保存备用。 　　1.3.3 pSilencer3.1-H1neo载体的线性化 取1.5 ml EP管，分别加入无核酶水78 μl，10×Buffer 10 μl，pSilencer3.1-H1neo载体10 μl，HindⅢ 1μl，BamH Ⅰ 1 μl，混匀， 37℃水浴保温8 h。取酶切产物5 μl在1%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察鉴定已切开。将所有酶切产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，长波紫外灯下切下4.2 kb左右线性化条带的凝胶，使用