组织DNA提取原理和步骤 详细.pptVIP

组织DNA提取 [实验目的] 学习从生物组织中提取DNA，为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础。 提取DNA总的原则： 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 原理： 粉碎组织DNP 裂解液 裂解细胞膜、核膜 DNP 苯酚、氯仿 ? DNA（RNA） RNA酶 Protase Ｋ 苯酚、乙醇 ? 纯DNA 紫外定量 各种组织细胞破碎方法 DNA鉴定(DNA identification) 浓度鉴定(concentration) 纯度鉴定(purity) 完整性鉴定(integrity) 浓度鉴定(concentration identification) 1）紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometery) 测定DNA在A260nm的光吸收值。 A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB），可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） 纯度鉴定(purity identification) 紫外分光光度法： 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，纯的DNA， A260与A280之比应在1.80；低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。 纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。 完整性鉴定(integrity identification) 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。 核酸的贮存——DNA保存 (storage) 1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的pH与DNA 贮存有关，pH为8时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 2）长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 方法： 每克组织 + ml裂解液 组织匀浆器，匀浆 取2.0ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min， 2,500rpm 10min 取水相 加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min, 2,500rpm 10min 取水相 加5M NaCl至终浓度0.3M NaCl, 加2.5倍体积 冰无水乙醇 ，摇匀 见白色沉淀,玻棒挑起 DNA 70%乙醇洗涤一次 沉淀溶于1ml TE ? 适当稀释 紫外分光光度计测A260nm,A280nm 定量 吸取DNA原液 μl，用ddH2O稀释至 μl ，在紫外分光光度计上测定A260nm及A280nm，计算A260nm/A280nm比值及DNA浓度。一般以A260nm/280nm≈1.8为标准。 A260nm/A280nm若＜1.6，提示有蛋白质或酚污染，应进一步纯化。 浓度计算 DNA浓度（μg/ml）= A260nm× 50 × 稀释倍数 × 1/光径 *1OD值相当于50μg/ml dsDNA，40μg/ml ssDNA或RNA，2Oμg/ml寡核苷酸。 试剂及其作用 1.裂解液（Homogenization buffer）: 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 0.1mol/L NaCl 1%SDS EDTA:抑制DNA酶活性 SDS是离子型表面活性剂