张新祥《生化分析》第5.1章 生化分析-酶免疫分析.pdfVIP

杨丽 2014.4.15  酶免疫分析概述  酶标记试剂及标记 影响酶免疫分析的因素  酶免疫分析应用举例  酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA） 表达免疫  免疫分析法分类 放射免疫分析法 化学发光免疫分析法 标记免 电化学免疫分析法 疫分析 荧光免疫分析法 竞争性酶联免疫分析 免疫 分析 酶联免疫 非竞争性酶联免疫分析 分析法 均相酶联免疫分析 非均相酶联免疫分析 非标记免 沉淀反应、凝集反应、 疫分析 免疫电泳、免疫扩散  酶免疫分析（EIA ）  EIA代表了这样一类免疫分析方法，它利用酶催化底物 的反应以产生有色的、发光的或荧光的产物而被检测。 根据酶的放大效应可以建立多种灵敏的分析方法。  将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相 结合 • 非均相酶免疫分析使用较多，测定前需要固-液两相的分离。 • 与此相反，均相EIA在测定之前不需要结合与游离相的分离。  非均相酶免疫分析原理（以ELISA为例） 1.将抗体吸附在固相载体上， 2.加入含有抗原的待测溶液 封闭其他活性结合位点 3.加入抗原-抗体结合物 4.加入酶反应底物，检测产物  均相酶免疫分析原理 基于标记抗原与抗体结合时会引起酶活性的改变。  酶免疫分析中使用的酶应具备的条件 ①纯度高、催化反应的转化速率高、专一性强； ②具有足够的偶联用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较 高的催化活性； ③使用稳定性和保存稳定性好； ④测定酶活性的方法简便、灵敏、快速； ⑤待测体液中不存在与标记酶相同的酶； ⑥待测溶液中应该无底物、反应抑制剂和其他与酶发生反应的干扰物质； ⑦酶的来源、纯化和供应较方便，价格较低廉； ⑧具有简单而温和的标记反应条件； ⑨均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原-酶结合物结 合后，酶活性表现出抑制或激活。  酶免疫分析中的常用酶  β- Ｄ-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，β-Gal）  碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase ，AP ）  过氧化物酶（peroxidase ） • 共同点：灵敏度恰当、商品化、纯度价格适中 • 不同点：酶活性测定的难易、安全性  酶标反应  反应功能基：氨基、巯基、二硫化物、马来酰胺残基及活化或非活 化羧基等  标准： 酶标记反应要尽可能小的影响酶和免疫反应的活性； 酶与连接物之间的化学键在EIA 条件下稳定； 酶的标记率要低； 自由态酶及被标记物质应尽可能完全地与结合物分离； 抗原或抗体上所标记的酶数目要一致，且能够控制。  影响免疫反应的因素  抗原与抗体的反应一般在中性的0.1-1.0 ml的缓冲液中温育 1-48 h 。但对均相EIA ，在加入底物之前典型的温育时间为 1min。最常用的缓冲液是磷酸缓冲的生理盐水（PBS）， 其中也可能含有血清白蛋白，氯化镁及其它试剂来稳定酶 的活性。  提高反应温度和试剂浓度可以提高试剂向固相表面扩散的 速度，应注意的是过高的温度可能会降低酶的活性。  酶活性的测定可以在反应过程中的任何时间进行。  桥基的影响  当氚被用作标记物时，标记的和非标记的抗原在免疫