原位杂交技术原理及.pptVIP

单个或多个全染色体（WCP) 探针 探测缺失 探测易位 bcr / abl * 杂交到有爪蟾蜍染色体上的卫星探针(SAT1) * Multi- color ISH TMB - chr. 1 DAB - chr. 15 NF - chr. 7 Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI) 多色原位杂交 * 人类频谱染色体组型分析 频谱 FISH 多色原位杂交 * 实习课 实习时间： 共聚焦：1月12日2：30 共聚焦实习地点：科研楼10楼， * Thanks * * * * * * * * * * （二）玻片和组织切片的处理 　　1．玻片的处理玻片包括盖片和载片 应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。 　　由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。 * 常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。 多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。 近年Vector Lab (U.S.A.)推出一种新的粘附剂叫Vectorband Reagent,每一单位包装可制备500～700张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。 * 2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。 这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。 * 蛋白酶K（Proteinase K）:1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。 蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。 在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。 * 多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外，还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。 * 3．减低背景染色 杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。 　　预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 * 4．防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。 要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。 * （三）杂交（Hybridisation） 　　杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸