卫生微生物检测的基本技术.pptVIP

当用脱色剂处理时， 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 * 步骤1：涂片 用接种环滴加1-2环或滴一小滴生理盐水，挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，菌膜直径在0.5~1cm。 火烤，酒精棉球 如果水多了，菌挑多了， 接种环灭菌从后往前 * 步骤2：干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。也可在酒精灯上方稍微加热（10cm ），但不能紧靠火焰。 步骤3: 固定 手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过2-3次，待玻片冷却后方可染色。 * 结晶紫染色 1min 水洗，用滤纸吸干。 刚好覆盖为宜 水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水 从载玻片的一端流下，水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。 步骤4: 染色 * 碘液媒染 1min，水洗，滤纸吸干。 95%酒精脱色 20-30s，水洗，滤纸吸干。 滴加：轻轻摇动，一般30s 流加：流出的乙醇无紫色。 * 番红复染 1-2min，水洗，滤纸吸干。 * 染色结果 步骤5: 镜检 干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准。 * 滴加香柏油。转动转换器时，不要用手指扳动物镜镜头。 从侧面注视，上升载物台，使油镜前端浸入香柏油中并几乎与标本相接。 旋动粗调节器，使载物台徐徐下降，直至出现物象，再用细调节器调至物像清晰为止。（反方向） 注意：方向 如果油镜已经离开油面，则必须重新从侧面注视，再将油镜头浸入油中，重复上面操作。 4、显微镜的使用 * 用干净擦镜纸擦去镜头上的油滴， 用乙醚-乙醇混合液润湿一新的擦镜纸，一个方向擦拭镜头1-2次，来回（×） 最后再用干净的擦镜纸擦去乙醚-乙醇混合液残渍。 将物镜镜头转成“八”字形。载物台降至最低。 显微镜的维护 * 制片的注意事项： 1. 载玻片要洁净无油迹。 2. 滴生理盐水不要过多。 3. 挑菌量宜少。 4.涂片要均匀，菌膜宜薄。 5.涂菌的动作要轻，防止菌液迸溅。 6. 沾有细菌的接种环要及时火焰灭菌。 四、 注意事项 * 1.选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 2.水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 3.酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 革兰染色的注意事项 * 显微镜使用中的注意事项 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 3.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布。 * 五、革兰染色结果报告： 绘图： ①镜下颜色，形状，排列方式； ②标注染色方法，放大倍数，标本号。 文字说明： 镜下可观察到：①有染成紫色的革兰阳性菌，球菌，呈单个、成双、短链或葡萄串状排列；②有染成紫色的革兰阳性菌，大杆菌，两端钝圆，芽胞位于菌体中心或次极端，呈散在或链状排列；③有染成红色的革兰阴性菌，短小杆菌，呈散在排列。 （双色笔） 革兰氏染色，×1000（目镜× 物镜），01 * 革兰染色 试剂 A B C D * 卫生微生物检测的基本技术 苏春丽 * 一 、实验目的 1、掌握无菌操作、平板制备、接种、革兰氏染色及镜检技术。 2、熟悉革兰氏染色的原理。 3、了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。 * 二、实验仪器与材料 大肠杆菌、芽胞杆菌 革兰氏染色液 载玻片 显微镜等 * 三、实验内容 * 1、无菌技术 火焰周围10厘米 * 液体培养基接种：接种环退出前，靠几下管壁，抖掉接种环上的菌液。接种环从后往前烧。 半固体培养基：穿刺接种 接种针 中间垂直 接近管底，但是不能刺穿 0.5-1cm 0.2-0.7% 2、接种 * 固体培养基：平板