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动物细胞核的分离与鉴定 临床六班第二组 * 小组成员 吴文胜：1110150626 夏禹： 1110150627 穆顺峰：1110150635 卢伟： 1110150640 * 实验大纲 小组成员 实验原理 实验步骤 注意事项 实验仪器、设备、器具表 实验试剂表 预期结果 * 二、实验原理 核体的制备方法:核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法和排除法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。 * XY 排除法制备核体:通过细胞松弛和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 * XY 细胞核的鉴定:因为细胞核中主要含DNA，呈酸性(但本组染的是细胞核的碱性部分）。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理, 抽提出核酸后，利用碱性固绿溶液染色性，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 * 三、实验步骤 1、细胞培养（因为培养时间过长，所以由老师帮助完成，选讲，试剂不用自备) 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后加入0.1μg/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60min。并固定在圆板上。 * XY 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后,再加入 10ml37℃的细胞松弛素B溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 * XY 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 　　　　 * XY 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8.染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 　　　　　　 * 四、注意事项 1、在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到 37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2、涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 * XY 3、在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全得不到理想的实验结果。 4、因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 * 五、实验仪器、设备、器具表 名称 规格、型号 数量 说明 普通光学纤维显微镜 1 离心机 1 量筒 载玻片、盖玻片 2 离心管，废液缸 4 * 实验试剂表 名称 规格、型号 数量 说明 秋水仙碱 0.1μg/ml 细胞松弛素B溶液 37℃ 15ml 乙醇 15% 三氯醋酸 90℃ 碱性固绿染液 0.1% * 预期结果 经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性蛋白，即细胞核。 * Thank you for attention! *