动物基因组DNA和RNA.pptVIP

三、动物基因组DNA的提取 （3）苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。 用苯酚处理匀浆液时, 由于蛋白与DNA 连接键已断, 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。 利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。 * DNA的提取：苯酚抽提法 1. 材料、设备及试剂 材料：冷冻或新鲜抗凝全血，组织样 设备：EP管、微量取液器(20μl, 200μl, 1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：裂解液 ligsis buffer（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠, 1mMEDTA, 1%SDS, pH8.0）、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、 NaAC＋ 、RNA酶、无水乙醇、灭菌水 * 1）在500μl抗凝血中加入ligsis buffer 1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2）沉淀中加入ligsis buffer 1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min 。 3）彻底弃去上清，加入extraction buffer 500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h 。 4）加入8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 2. 操作步骤（血样） * 6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 * 3. 注意事项——材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集 * 3. 注意事项——细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 高温温浴时，定时轻柔振荡 * 3. 注意事项——核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 * 3. 注意事项——核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 * DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 4. DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对 策 * 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 DNA样品反复冻融 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：DNA降解 对 策 原因 5. DNA提取常见问题 * 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前