几乎所有的生物都能合成自身所需.pptVIP

T4 DNA ligase 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。 * E.coli DNA ligase Mr=74000, 作用于5‘端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 * T4 RNA ligase 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3＇末端标记 * Ligation of DNA fragments in vivo and in vitro in vivo：不仅形成重组分子的效率低,而且还可能伴随着末端核苷酸的缺失。 in vitro： 减小了DNA进入细胞后遭受降解危险； 粘性末端体外连接将保护原来识别序列的完整 可以控制连接时的反应条件 * affecting factors T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5℃（4-15℃）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better * polymerase 催化核酸体外合成反应 * DNA polymerase 依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶Ⅰ(全酶); DNA聚合酶Ⅰ大片段 (klenow片段); 耐热DNA聚合酶 (Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶。 不依赖于DNA的DNA聚合酶:末端转移酶。 * RNA polymerase 催化RNA体外合成反应 依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶 * nuclease 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶 5‘-核酸酶或3’-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体 外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性 * 核酸酶的分类 内切酶 ──非专一性── 外切酶 ─3＇-核酸酶 核酸酶─ 内切酶─ ─5＇-核酸酶 ──RNA─ 外切酶 ─专一性─ 非限制性 ── 内切酶─ 限制性 ──DNA─ ──外切酶 * Kinase 激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 用途： 放射性标记DNA链的5‘末端，探针标记 Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5＇磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。 该酶很难纯化,酶制品经常不纯。 铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。 低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。 * 磷酸酶：去除核酸末端磷酸基团的酶。 细菌碱性磷酸酶(BAP)：E.coli中分离 牛小肠碱性磷酸酶(CIP)： 牛肠道分离，切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5＇磷酸基团, 从DNA片段上除去5＇磷酸以防自身连接。