第8章PCR技术及其应用-张静2014.pptVIP

2、3’ RACE原理示意图 二、差异显示PCR (differential display PCR,DD-PCR) 检测相似材料表达谱差异的经典方法，此后已衍生出许多新方法。 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? DD-PCR是在AP-PCR(任意引物PCR)基础上发明的一种RT-PCR方法，主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。 基本原理：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列，根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同，可以将所有的mRNA分子分为12类。 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即M’N’TTTTTTTT……，用其分别进行反转录，即可将所有mRNA分类合成12种cDNA（于12个试管内），然后再用锚定引物和随机引物，以这12种cDNA分别做模板进行PCR扩增，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。 真核生物12种mRNA的序列特点 DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物 一、多重PCR (multiplex PCR)： 在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。 引物 电泳 第五节 PCR产生的DNA指纹 二、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)： 在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，单一引物就可以扩增出多个PCR产物。RAPD引物一般为10-11nt。 三、扩增片段长度多态性 (amplified fragment polymorphism, AFLP)： 将高等真核生物基因组DNA酶切，连接接头，然后进行选择性PCR扩增。 PCR与模板定量：PCR最终产物是其模板一定程度的放大，因此PCR产物的量可以间接反映初始模板的量。但正因为PCR是对初始模板的指数式扩增，如果不同样品之间在扩增中偏离指数的程度稍有不同，用PCR产物来反映初始模板丰度就会有很大的误差。 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮产物的累积数量，可以很好地推算初始模板丰度，这种工作方式叫做实时定量PCR (real-time PCR)。 第六节 实时荧光定量PCR 一、实时荧光定量PCR的定量方式 RT-qPCR仪同时进行PCR扩增和荧光检测，监测动态变化。 阈值(threshold)：荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度值。 Ct值：荧光信号达到阈值所对应的PCR循环数，它具有极好的重复性。 基线：从第3个循环起到Ct值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般以3-15之间。 Ct值是一个完全客观的参数，通常在18-30之间。它与初始模板拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 * 二、荧光标记方式 1、SYBR Green荧光染料： 它结合到双链DNA的小沟中后发出荧光，非结合状态不发出荧光，通用性好，灵敏度高，价格相对较低，应用较为广泛。 缺点是对DNA没有选择性，特异性不强，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求较高。 * 2、水解探针(TaqMan探针) 利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。 该探针可与DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA，探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。 当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518 nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。 实时PCR技术原理 特点：特异性很高，特别适合SNP检测，设计相对简单，但成本高，只适合一个特定的目标。 探针设计一般应符合以下条件： ①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。 ②探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。 ③避免与引物发生杂交或重叠。 ④GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。 3、发夹型杂交探针 荧光基团和淬灭基团组成的探针，结构上是茎环结构，其中茎由互补配对的序列组成，环与目的序列完成配对，探针分子的两端分别