EGFP蛋白质的克隆表达.docVIP

PAGE  PAGE 12 EGFP大肠杆菌克隆与表达 一 实验目的 （一）掌握用PCR技术进行克隆扩增的方法。 （二）掌握利用琼脂糖凝胶电泳同时进行PCR扩增产物的监测和纯化的方法。 （三）掌握进行DNA片段限制性内切酶双酶切的方法。 （四）掌握用T4DNA连接酶完成DNA片段的连接。 （五）通过转化实验了解在大肠杆菌里表达真核蛋白质需要的不同的培养条件；观察到由于表达了EGFP蛋白质而发绿色荧光的菌落。 （六）掌握重组子转化子的纯化和重组子鉴定的一般方法。 二 设备、材料与试剂 （一）设备 PCR仪、微量移液器、PCR薄壁管、凝结图像分析仪、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴（台板）、电子天平、EP管、恒温培养箱、恒温摇床、无菌工作台、低温冰箱。 （二）材料 PCR反应成分：Pfu酶、引物、dNTP、EFGP模板质粒pEGFP-C1等。 电泳缓冲液各成分、表达载体pRSETA、IPTG、LB培养基成分、琼脂粉、手术刀、玻璃试管、三角瓶、枪头、塑料离心管、感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α。 （三）试剂 PCR酶试剂：2×Pfu PCR Master Mix DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ T4 DNA连接酶及随酶的10×反应缓冲液 质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素、氯霉素 IPTG储夜（200mg/ml）：在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.32μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。 含有氨苄青霉素和氯霉素的LB筛选培养基。 感受态细胞制备试剂。 LB液体培养基。 三 实验步骤 （一）EGFP基因的克隆扩增 利用从大肠杆菌的过夜培养液提取的质粒pEGFP-C1作为模板，EGFP基因的特异性引物通过PCR技术扩增EGFP基因。 向灭菌的PCR薄壁管里依如下表的顺序加入： 成分一个反应（μL）无菌水(dH2O)21.110×reaction buffer (无Mg2+)325Mm MgCL21.8dNTP(each 2.5mM)110pmol/μl的引物1110pmol/μl的引物21模板质粒（约100ng/μl）0.5Taq酶0.6总体积30轻轻混匀，低速离心5秒。置于PCR仪进行扩增，扩增程序为： 95℃（1min）→[94℃（50s）→55℃（5s）→72℃(加入pfu酶，42s)]×30个循环→72℃（5min）→4℃ 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过与Marker条带进行比对，对目标产物进行鉴定。 （二）扩增基因的纯化回收 (1)、在紫外成像仪下用手术刀从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块，并置于1.5ml塑料离心管中，并称重。 (2)、计算出凝胶的重量后，每100mg凝胶加入400μl Bingding Buffer B。 （3）、凝胶溶解：55-60℃，保温5-10min，每2min混匀一次。 （4）、加于2ml洗管上的小柱子上。室温放置2min，室温6000rpm离心1min。 （5）、取下小柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一收集管中，加入500μl Wash solution，室温12000rpm离心1min。 （6）、重复步骤5一次。 （7）、取下小柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放入到同一收集管中，室温12000 rpm离心1min。 （8）、将柱子放入新的离心管中，打开盖子，37℃，3-5min。在柱子膜中央加入预热的ddH2O 30-40μl，37℃放置2min。 （9）、室温12000 rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 （三）、DNA片段限制性内切酶双酶切 （1）、PCR回收产物双酶切 按下表构建反应体系。 成分×1（μl）无菌水010×buffer(EcoRⅠ)4胶回收DNA35BamHⅠ0.5EcoRⅠ0.5总体积40（2）、载体双酶切 按下表构建反应体系。 成分×1（μl）无菌水2.510×buffer(EcoRⅠ)1.5胶回收DNA10BamHⅠ0.5EcoRⅠ0.5总体积15（四）、双酶切目标基因片段的纯化回收 (1)、在紫外成像仪下用手术刀从电泳板上分别切割含目的DNA及载体片段的凝胶块，分别置于1.5ml塑料离心管中，并称重。 (2)、计算出凝胶的重量后，每100mg凝胶加入400μl Bingding Buffer B。 （3）、凝胶溶解：55-60℃，保温5-10min，每2min混匀一次。 （4）、加于2ml洗管上的小柱子上。室温放置2min，室温6000rpm离心1min