第四章 高效液相色谱幻灯片1.pptVIP

第四章 高效液相色谱(HPLC) (High Performance liquid chromatography);第一节 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱) 等。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间很长！; 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 ?m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解???了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。;1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压：液相色谱用液体作为流动相，液体流过色谱柱时，阻力较大，因此需加高压，150～350?105 Pa。 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高，3万塔板/米而GC2000塔板/米。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。;2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物(能气化），而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。;3. 应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 ;第二节 HPLC仪器 HPLC仪器包括：1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 ;1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔约2 ?m，可防止颗粒物进行泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3）高压泵：输送流动相 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力变化而变化，现已较少使用。 ; 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵。每分钟往复25~100次，因此脉动小。 4）梯度淋洗装置：梯度洗提：载液中含两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序改变载液的溶剂配比和极性，以便提高分离效果，缩短分析时间。;2. 进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。 ;3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm。标准柱型4.6或3.9mm，长度15～30cm的直型不锈钢柱。 2）柱的填充：主要采用匀浆法（湿法），以一合适的溶剂或混合溶剂作为分散介质，使填料微粒在介质中高度分散，形成匀浆，然后，用高压将匀浆