球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建.pdfVIP

第 ??卷第 ?期? 长春师范学院学报?自然科学版 ?? ????年 ?月? ??????? ??．?? ??????????????????????????????????????????????????????? ???．????? 球孢 白僵菌海藻糖一?一磷酸合成酶? ?????真核? 表达载体 的构建? 谢 翎?一，黄 勃? ??．安庆师范学院生命科学学院 ，安徽安庆 ???????；?．安徽农业大学林学与园林学院，安徽合肥 ???????? 【摘 要】本研究 针对球孢 白僵菌 的 ???基 因 ，通过双酶切和??连接 ，构建 了? ??基 因的真 核表达? 载体??????／???。???鉴定 和测序表 明 ，该 重组质粒 包含 了球孢 白僵 菌 ????基 因 的全 长????序? 列 。并???????基因被正确地插入到 ????????质粒 的表达框 中。因此 ，该重组质 粒可以直接用于? ????基 因的酵母表达。? 【关键词】???基 因，??????载体 ，重组质粒? 【中图分类号】????．??? ?文献标识码】?? 【文章编号】????— ????????????—????—??? 酵母作为真核单细胞生物 ，兼有原核生物和真核生物的某些优点 。与原核生物表达体 系相 比，利用酵? 母对外源基因进行真核表达具有诸多优势 ：繁殖迅速 ，培养廉价 ；酵母结构简单 ，便于进行异源基因的遗? 传操作 ；具有蛋白翻译后修饰能力哪；可在信使???翻译时去 甲硫氨酸 ，避免药物使用中产生免疫反应。 目? 前技术最成熟 ，应用最多的酵母表达系统是毕赤酵母 ?????????????????。? ??????质粒含有???基因，使毕赤酵母具有????抗性。????抗性水平主要依赖整合的 ???基因的数 目。? ???基因与表达盒间具有遗传连锁 ，因此从????抗性可推断其所含有的插人基因拷贝数 。? 目前 ，国内外利用这种表达体系已成功表达多种异源蛋白????。但迄今为止 ，关于昆虫病原真菌海藻糖? 一 ?一磷酸合成酶??????在毕赤酵母 中实现真核表达的研究还未见报道 。本研究首次构建了球孢 白僵菌海藻? 糖一?一磷酸合成酶基??????真核表达载体 ，为海藻糖一?一磷酸合成酶 的蛋白研究及大规模发酵生产奠定了基? 础 。? ? 材 料和 方法? ?．? 材 料? ?．?．? 实验菌株与质粒? 含球孢 白僵菌海藻糖一?一磷酸合成酶基 因????的质粒?????一?／??????，由实验前期构建。分泌型真核表? 达穿梭载体??????与大肠杆菌?????菌株 由本实验室保存。? ?．?．? 试 剂? ??????聚合酶、?????一?载体 、???胶 回收试剂盒均购 自大??宝生物公司。引物合成 由上海生工生? 物工程有限公司完成 。其他常用试剂均为国产分析纯试剂。? ?．? 实验方法? ?．?．?? ??????基因的真核表达载体??????／?????的构建? 根据球孢 白僵菌海藻糖一?一磷酸合成酶基?????序列及真核分泌型表达载体??????表达框及多克隆插入?