3细胞的破碎与分离.ppt

1、细胞壁的破碎 细胞壁是具有一定刚性和坚韧性的物质。;细胞的破碎与分离;B、液体剪切法（高压匀浆法） 细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀座之间的环系高速（可达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50~70Mpa。;细胞的破碎与分离;?优点： ①产品释放的选择性高②抽提的速率和收率高③产品的破坏极少④对外界条件要求低⑤不残留细胞碎片。 缺点： 酶难以回收，费用高 使用事项：采用组合酶或结合其他因素;细胞的破碎与分离;①若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法，若在细胞膜附近则可选用较温和的破碎方法， ②若提取的产物与细胞膜或细胞壁相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法 ③破碎方法应尽可能使产生的碎片少而大，以利于后续分离 ④考虑选用多种破碎方法相结合的形式 ⑤改善培养条件;（1）基因工程表达产物的特殊性 ①形成包含体 ②N-末端多一个氨基酸残基，失去糖基及过度糖基化 ③内毒素及目标蛋白的破坏 ; 细胞的破碎与分离;蛋白质复性时通常用膜透析法和凝胶过滤除去变性剂和还原剂，或用稀释法把它们稀释到适当的浓度。 注意事项：复性应尽量不采用突然改变变性剂浓度的办法，因为这样会导致折叠中间体的聚集。不同蛋白质应采用不同的变性剂去除速率。对具有二硫键的重组蛋白，需加入氧化剂协助二硫键的形成，常用氧化剂有谷胱甘肽、半胱氨酸和空气。复性时必须对温度、pH,离子强度等进行严格的限制 。;包含体的形成机制 目前的研究认为，包含体的形成有如下原因： ①表达蛋白的速率过快、浓度过高，生成的蛋白质没有足够的时间和空间折叠形成正确结构；②蛋白在折叠过程中疏水区暴露于溶液中，分子间的相互作用形成错误折叠导致凝集；③表达环境的细胞内部还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，出现错配或多余的二硫键；④培养温度、pH值、某些金属离子等因素影响⑤原核系统缺乏真核系统对真核生物蛋白的加工和修饰功能。