1石蜡制片 2电镜 3徒手切片法.ppt

第五章 园艺植物制片方法 植物制片是进行园艺植物科学研究所需用的一种基本方法，比如进行植物各个器官的解剖构造观察、花芽分化研究、授粉受精观察、贮藏营养观测以及染色体观察等都需要进行制片。通过对切片结果的分析，可以比较不同试验处理的效果以及了解不同树种和品种相应的生物学特性等。植物制片技术是一个相对独立的体系，内容繁多。在本章内容中，将介绍在园艺植物科学研究中常用的一些基本方法和原理。 ; 第一节 徒手制片 一、徒手制片（切片）及特点 徒手制片一般指徒手用刀片把新鲜的植物材料切成薄片的制片方法。 此制片法主要优点是：（1）能及时观察研究植物生活组织的结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需切片机等机械设备，短时间即可完成。主要缺点是（1）对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手切成薄片；（2）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完整的切片。 ;二、徒手制片的方法及注意事项 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利。切片方法及步骤为： （1）准备工作（盛好清水的培养皿、显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等用具）。 （2）拿取材料进行切片，材料可以是新鲜的材料，也可以是经过固定的材料（切片时，将欲切材料断面和刀片上滴上清水以保持材料湿润）。; （3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指应低于食指，以免切伤手指；材料高出指尖。 （4）右手执刀，将刀平放在食指上，刀口朝内，刀面与材料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移动，不要用腕力。同时还要注意，切时动作要迅速，材料一次切下，切忌停顿或拉锯式切割。 ;（5）连续切数片后，将切下的薄片轻轻移入盛水的培养皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上的水滴中，加上盖玻片制成临时制片进行观察。 在试验中，有时因各种情况所取材料无法马上进行制片。可以将其保存在固定液中，常用的固定液为F.A.A固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保存液 ，其配方为：5ml福尔马林（甲醛）：5ml冰醋酸：50-70%的乙醇90ml。; 用徒手切片的材料不宜过大，一般以表面不超过5-8mm2 为宜。对于过于柔软或微小的材料（如叶片、细小的根尖等）需要借助一些夹持物方可进行切片，如果临时制片需保存一段时间，（1）将材料封在水中，每隔20-30分钟再加一滴水，此法可保持数小时；（2）用10%-30%的甘油水溶液代替清水封片，并将制片放在铺有湿滤纸的大培养皿中保存，或用石蜡或指甲油封边保存，可保存1-2周或更长时间。 ;; 进行染色体观察时注意，若进行染色体数目测定要求取样个体数在5个以上，细胞总数在30个以上；若进行染色体核型分析（组型分析)则要求取样应是来源于不同个体的5个细胞。 一、常规压片法 ?1.取材：于细胞分裂旺盛时期取样。一般取根尖、茎尖。 ?2.预处理：防止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期阶段；使染色体收缩变短，便于观察统计。常用药剂有秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、富民隆。预处理的时间一般为2-12小时。; 3. 固定：把细胞迅速杀死，使蛋白质变性沉淀，尽量保持材料结构的原有状态，以备进一步处理。 ???? 常用的固定液为卡诺固定液，即3：1的纯酒精:冰醋酸溶液。固定时间一般为1-24小时。 4.解离：根尖、茎尖等体细胞组织，需经过某些处理，除去细胞之间的果胶层并使细胞软化，这种细胞分离和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水解和酶处理两种。;５．染色：常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色剂进行染色。 ６．压片：将材料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。 ７．镜检：将压片置于显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行统计记数，并可照相绘图，以便进行核型分析。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次观察和照相。;８．封固：好的压片，可采用冷冻干燥后，用光学树胶封固保存。也可进行脱水透明等步骤制成永久切片。若临时保存，可以用石蜡封边，放于培养皿中于冰箱冷冻室内短期保存。 二、去壁低渗法（涂片法） 1.取材：同上述常规压片法。 2.预处理（前处理）：同上述常规压片法。 3.前低渗：将处理后的材料防灾0.075M KCl低渗液中，在20-25℃条件下处理30分钟左右.;;;4．去壁：倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液（纤维素酶与果胶酶各占2.5%），在温