实验聚丙烯酰胺凝胶电泳.docVIP

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 一 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。 圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。 仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。 图A 在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明： 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。 分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。样品在其中进行电泳和分子筛分离。 蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大， 速度就减慢了。由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩， 区带变窄。（2）缓冲离子成分的不连续性。(3)电位梯度的不连续性。(4)pH的不连续 性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应 有的pH为8.9。 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓的分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。 此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛效应，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出来，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。 电荷效应：蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有的电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起作用。 二 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理 性能：聚丙烯酰胺的机械强度好，有弹性，透明，相对地比较稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适合于少量样品的制备，不致污染样品。 制备原理：聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（acrylamide 简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N,N,N,’N’-methylene bisacrylamide简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： （1）化学聚合：化学聚合的催化剂多采用过硫酸铵（ammonium persulfate简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’- -四甲基乙二胺（N,N,N,’N’-tetramethyl ethylenediamine,简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,简称DMPN）。在叔胺的作用下，由过硫酸铵形成的氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合作用。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。 当聚合反应开始时，过硫酸铵溶于水产生自由基S2O82-→2SO42-，这些自由基活化TEMED使之形成带不成对电子的活化分子。活化的TEMED与丙烯酰胺分子或甲叉双丙烯酰胺