高速逆流色谱快速分离四种甘草黄酮及其结构鉴定.PDFVIP

分析与测试 高速逆流色谱快速分离四种甘草黄酮及其结构鉴定 高 　蕾1 杨光丽2 陈俐娟3 (1. 四川大学化学工程学院 ,成都 ,610065 ;2. 四川大学药学院 , 成都 ,610065 ;3. 四川大学肿瘤生物治疗国家重点实验室 ,成都 ,610041) 摘 　　要 　　通过高速逆流色谱从新疆产甘草粗提物中分离得到甘草黄酮醇、甘草素、芒柄花素和甘草异黄 酮甲四种甘草类黄酮。溶剂系统为正己烷2乙酸乙酯2甲醇2水 (1 ∶2 ∶1 ∶1) ,上相作为固定相 ,下相 作为流动相 ,主机旋转方向为顺时针 ,转速 850rp m ,流速 410mL/ min ,检测波长 260nm。经过 160min 分离 ,从 400mg 甘草粗提物中得到甘草黄酮醇 26mg、甘草素 8mg、芒柄花素 12mg、甘草异 黄酮甲 10mg ,纯度分别为 9613 %、9517 %、9815 %、9818 %。结构经熔点、UV、MS、1 H2NMR 和 13 C2NMR鉴定。 关键词 :高速逆流色谱 甘草黄酮醇 甘草素 芒柄花素 甘草异黄酮甲 引言 甘草属 (glycyrrhiza)植物系豆科蝶形花亚科多 年生草本植物。该属在我国产有 18 种 3 个变种 ,分 别为豆科植物甘草 ( Glycyrrhiza uralensis Fisch. ) 、 胀果甘草 ( Glycyrrhiza inflata Bat . ) 和光果甘草 ( Glycyrrhiza glabra L . ) [ 1 ] 。甘草是我国传统中药 , 素有“十药九草”之称 ,在传统中医药中被称为“国 老”。现代研究发现 ,甘草除了传统的镇痰去咳、清 热解毒、抗炎、抗变态作用外 ,还有良好的治疗急慢 性病毒肝炎和抗肿瘤的效果。其中甘草中的黄酮类 成分被证明比甘草酸具有更好的抗肿瘤疗效[2～4 ] 。 因植物甘草种属多样 ,不同种属甘草粗提物所 含成分差别较大 ,且有效成分含量低 ,故市场上一直 缺少甘草黄酮的相应标准品。本实验首次成功用高 速逆流色谱从豆科甘草 ( Glycyrrhiza uralensis Fisch. )中分离得到甘草黄酮醇、甘草素、芒柄花素 和甘草异黄酮甲四种黄酮成分 ,纯度均达到 95 %以 上。据研究显示 ,其中甘草素具有抑止过氧化物阴 离子的产生、抗氧化溶血及保护红细胞的作用[2 ] 。 甘草异黄酮甲具有雌性激素样作用 ,可抑止乳腺癌 细胞增殖[3～4 ] 。 高速逆流色谱作为一种不需要固态载体的液2 液分配色谱 ,现已在天然产物分离纯化领域得到广泛应用。与传统柱层析法相比 ,它具有分离速度快、样品吸附低、分离重现性好等优点[5 ] 。在此以前 ,这些成分通常采用硅胶柱层析法分离 ,速度较慢 ,重复效果不够理想。用高速逆流色谱法不仅使分离速度大为提高 ,且根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品 ,对深入研究甘草黄酮药效作用机制有重要意义。 图 1 四种馏分结构式 43 四川化工 　　　　　　　　　　　第 10 卷 　2007 年第 2 期 1 实验部分 111 仪器、试剂和材料 TB E300A 高速逆流色谱仪 :上海同田生化技术 有限公司 ; A KTA prime 泵及紫外检测系统 :美国 GE 公 司 ; HX21050 恒温器 :北京博医康实验仪器有限公 司 ; Alliance 2996 高效液相色谱仪 :美国 Waters 公司 ; 色谱柱 : Sunfire C18 (120mm ×70mm , 5μm) , 美国 Waters 公司 ; Mercury plus 400 核磁共振仪 :美国瓦里安公 司 ; Waters Q2tof 质谱仪 ; 申光 WRS21B 数字熔点仪 :上海申光仪器仪表 有限公司。 甘草粗提物制备及 HSCCC 分离用溶剂 (正己 烷、乙酸乙酯、甲醇等) :均为分析纯 ,天津科密欧化 学试剂厂 ; HPL C 分析用乙腈 :色谱纯 ,Fisher chemicals ; 实验用水 :经 Millipore 超纯水制备系统净化 ; 甘草 :药材购自成都中草药批发市场 ,产地新 疆。 112 样品制备 称取 5kg 甘草 ,粉碎 ,过 40 目筛 ,用 70 %乙醇 按体积比 3 ∶1 在室温 (28 ℃)下浸泡三天 ,将所得浸 泡液旋蒸近干 ,得到浸膏。将浸膏用 70 %甲醇重溶 解 ,依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取乙酸 乙酯萃取层旋蒸干 ,置于真空干燥箱 45 ℃中完全干 燥 ,得到红棕色粉末 561g (即得实验用甘草粗提 物) 。 113 两相溶剂体系及样品溶液的制备 本实验所用溶剂系统为正己烷2乙酸乙酯2甲醇2 水 (1 ∶2 ∶1 ∶1) ,四种溶剂按比例配置于分液漏斗 中 ,充分振荡后静置 ,待平