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探讨MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性研究 　　摘要：目的 本研究采用重组色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）转染小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后，评估MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性。方法 Ad-PEDF在HEK293细胞中扩增，并纯化后。将其转染入MSCs（MSCs-PEDF），用Western Blot和ELISA检测培养上清液中PEDF的表达。结果 用Western Blot检测细胞培养上清中的PEDF为阳性表达。ELISA检测培养上清中PEDF浓度为78.8±4.8 ng/ml。结论 MSCs可以作为使用PEDF基因治疗肿瘤的载体。 　　关键词：骨髓间充质干细胞；色素上皮衍生因子；基因治疗；抗血管生成 　　血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件[1]，因此，抗血管生成治疗是肿瘤治疗的一个重要部分。色素上皮衍生因子（PEDF）是已知最强的内源性血管生成抑制因子，可通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移及诱导其凋亡来发挥其抗血管生成作用[2]。重组PEDF蛋白以及病毒载体介导的PEDF基因治疗已应用于多个实验研究，并显示出治疗前景[4]。骨髓间充质干细胞（MSCs）作为一种新颖、有效的靶向肿瘤细胞的载体可能为提高PEDF的治疗效果提供一种新的策略[3]。本研究拟通过重组色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）转染小鼠MSCs后，从而评估MSCs作为肿瘤基因治疗的载体的可行性。 　　1 资料与方法 　　1.1细胞培养 　　1.1.1 293细胞的培养 将293细胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2， 95%湿度条件下的孵箱中培养，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3d传代一次。 　　1.1.2人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的分离及培养 取产后新鲜脐带15～20cm，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端注入0.1%的胶原酶消化。将收集的消化液体离心（1500转/min）3min。接种于培养瓶中，置于孵箱中培养。 　　1.1.3小鼠MSCs的分离、培养及鉴定取。6～8周龄C57BL/6雌性小鼠，处死后在无菌条件下取股骨和胫骨，离心后用含有10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，并接种于方瓶中，置于孵箱中培养。 　　1.2 PEDF重组腺病毒载体（Ad-PEDF）的扩增与纯化 　　1.2.1 Ad-PEDF的扩增 将293细胞传代培养，当其密度达到90%时，加入适量病毒上清感染细胞。约2～3d后出现细胞病变，待细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮时，收集细胞上清液至离心管中，3000转/min，4℃，离心10min，将上清液用0.45μm滤器过滤，保存于-80℃。 　　1.2.2病毒纯化 使用Vira TrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit 纯化病毒（具体步骤见说明书）。 　　1.2.3病毒滴度测定（TCID50法） 将293细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，将病毒液按对数级稀释（10-5～10-10），每个浓度设置10个复孔，连续观察10d后记录每个稀释度出现CPE（致细胞病变效应）的孔数，计算细胞病变率。如果某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0。 　　1.3重组腺病毒体外感染MSCs 加入含有适量 Ad-PEDF 重组腺病毒低糖DMEM，感染复数（MOI）=1500，摇匀，置于孵育箱中培养4h后换液，48h后收集感染后MSCs。 　　1.4检测 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的体外表达 　　1.4.1样品制备 加入Ad-PEDF的MSCs作为对照。收集各组的培养液上清，采用Western blot 体外表达的PEDF蛋白进行鉴定分析，采用ELISA测定培养上清中PEDF浓度，分别测定三组培养上清中的PEDF浓度。 　　1.5统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，实验所得数据采用（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）；P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离培养和鉴定 MSCs的原代培养：原代细胞生长较慢，2w左右可长满瓶底，传代后细胞生长速度则明显加快，可得到较高纯度的MSCs。传代3次后，细胞形态较为一致，呈长梭形，多为平行排列生长或漩涡状生长。 　　2.2重组腺病毒验证及滴度测定 DNA电泳显示Ad-PEDF泳道在1200～1500bp之间出现一单一条带。说明扩增的腺病毒含有PEDF基因。 　　2.3 Ad-PEDF转染MSCs后重组PEDF的体外表达检测 转染了Ad-PEDF的MSCs（MSCs-PEDF）细胞裂解液及培养液上清在50KD处