遗传学实验任务书.docVIP

遗传学实验 实验一 原生质体的制备与融合 实验目的 原生质体是指细胞去掉细胞壁的裸露部分。它在培养条件下，具有再生细胞壁，进行连续的细胞分裂并再生成完整植株的能力；具有摄取外源大分子、细胞器，以及细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料；通过同种和异种的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，培育出新品种。通过此实验，要求初步掌握原生质体分离和培养的基本操作技术和方法。B1、琼脂条等。 方法与步骤 1、 菌丝体收集：将活化后的菌株接种于PDA平板上，30℃恒温培养4~6d。用直径5mm打孔器在平板上打出若干个菌饼，再用灭过菌的镊子小心挑出圆形菌丝饼，备用。（注意：菌丝饼不要附着有培养基） 2、酶解：取菌丝饼若干块，放入装有3.0%(w/v)溶壁酶液的无菌试管中，30℃水浴振荡，酶解3小时，得到原生质体粗提液。 3、原生质体纯化：在超净工作台内，将原生质体粗提液用无菌注射器（内筛有0.5-1cm厚度的棉花）过滤未被酶解的菌丝段，得到的滤液经4000 r/min离心5 min，去上清液，沉淀再用稳渗剂重悬离心2次，得到纯化的原生质体，备用。 4、原生质体计数：将纯化的原生质体加入500μL渗透压稳定剂制成悬浮液，取100μL滴于血球计数上，在显微镜下观察原生质体形态。 5、原生质体融合： 1）原生质体的灭活 根据以上纯化后的齿毛和平菇原生质体悬液 2 mL于无菌离心管中，置于恒温水浴中55℃水浴灭活60 min，其间不断摇动离心管使之受热均匀。 2）原生质体融合 取热灭活后的齿毛菌原生质体250μL，按1：l加入平菇原生质体，再加入1 mL融合剂，在32℃下温育25 min，3000 r/min离心10 min，去除融合剂，清洗2次，适当稀释。分别吸取100μL稀释后的原生质体及经融合处理的原生质体悬液，均匀涂布于3种不同原生质体再生培养基上，在30℃下恒温培养6~8d后观察再生菌落个数。 取热灭活后的平菇原生质体250μL，按1：l加入齿毛菌原生质体，再加入1 mL融合剂，在32℃下温育25 min，3000 r/min离心10min，去除融合剂，清洗2次，适当稀释。分别吸取100μL稀释后的原生质体及经融合处理的原生质体悬液，均匀涂布于3种不同原生质体再生培养基上，在30℃下恒温培养6~8d后观察再生菌落个数。 取齿毛菌原生质体250μL，按1：l加入菇原生质体，再加入1 mL融合剂，在32℃下温育25 min，3000 r/min离心10 min，去除融合剂，清洗2次，适当稀释。将融合处理的原生质体悬液，均匀涂布于3种不同原生质体再生培养基上，在30℃下恒温培养6~8d后观察再生菌落个数。 取热灭活后齿毛菌原生质体250μL，按1：l加入热灭活平菇原生质体，再加入1 mL融合剂，在32℃下温育25 min，3000 r/min离心10 min，去除融合剂，清洗2次，适当稀释。将融合处理的原生质体悬液，均匀涂布于3种不同原生质体再生培养基上，在30℃下恒温培养6~8d后观察再生菌落个数。 6、融合菌株观察 观察再生培养基上形成的菌落，进行菌丝体形态观察等。 实验前准备： 1) 0.6 mol/L甘露醇渗透压稳定剂的配制：称取10.94g甘露醇，加水溶解后，定容至100 mL，115℃ 蒸汽灭菌20 min后，备用。 2）3.0% (w/v)溶壁酶的制备：称取0.015g溶壁酶，取5mL已灭菌的0.6 mol/L甘露醇稳渗液充分溶解，% (w/v)溶壁酶液，用一次性微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌。(PEG)4000，1.38g CaCl2，27.36g甘露醇定容至250 mL。（注：由第1组同学配好各小组共用） 4）再生培养基配制：（注：每种培养基每个小组各配400 mL分装于250mL锥形瓶中） RMl(1L)：蔗糖0.6 mol/L，马铃薯葡萄糖水 24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖l0 g，磷酸二氢钾0.46 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 0.2 g，琼脂 20 g，调pH为5.5。 RM2(1L)：甘露醇0.6 mol/L，马铃薯葡萄糖水 24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖l0 g，磷酸二氢钾0.46 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 0.2 g，琼脂 20 g，调pH为5.5。 RM3(1L)：KCl 0.6mol/L，马铃薯葡萄糖水 24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖10 g，磷酸二氢钾0.46 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 0.2 g，琼脂 20 g，调pH为5.5。 4) 需灭菌材料： 枪头、镊子、离心管、滤纸、脱脂棉、涂布棒、培养皿、试管等。