DNA重组技术的基本工具__培训课件.pptVIP

ＥcoRI限制酶 SmaI限制酶 识别序列 －ＣＣＣＧＧＧ－ 切割位点 Ｇ和Ａ之间 Ｃ和Ｇ之间 未端类型 平末端 粘性末端 －ＣＴＴＡＡＧ－ －ＧＧＧＣＣＣ－ －ＧＡＡＴＴＣ－ 限制酶所识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 图1-1 限制酶识别序列的中心轴线 思考:限制酶所识别的序列有什么特点？ 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 例题： 1、下列关于限制酶的说法正确的是（ ） A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少 B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键 B 想一想: 这类酶在原核生物中起什么作用? 为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 二. DNA连接酶——“分子缝合针” 将双链ＤＮＡ末端之间的缝隙“缝合”起来 1.作用： 2.种类：（1）E·coliDNA连接酶 （2）T4DNA连接酶 DNA连接酶的作用过程 点击播放 DNA聚合酶与DNA连接酶 相同 区别 DNA聚合酶 DNA连接酶 将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 形成磷酸二酯键 以一条DNA链为模板 不需要模板 种类 项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 作用部位 作用结果 与DNA分子相关的酶 DNA分子 DNA分 子片段 脱氧核苷酸 DNA分子 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 碱基对间 的氢键 形成黏性 末端或平 末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链 DNA分子 三、基因进入受体细胞的载体－－“分子运输车” 1.使用载体的目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中；二是利用它在宿主细胞内进行大量的复制。 2.载体的种类：（1）质粒 （2）λ噬菌体的衍生物 （3）某些动植物病毒 3.作为基因工程使用的载体必需满足以下条件： 1）载体DNA 必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，才不至于因目的基因的插入而失活。 2）载体DNA 必须具备自我复制能力，或整合到受体染色体DNA 上，随染色体DNA 的复制而同步复制。 3）载体DNA必须有标记基因，以便重组后进行筛选。 4）载体DNA 必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和体外操作。 对照组：不添加抗生素 实验组1：添加一定浓度的四环素 实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素 实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素 对照组 实验组1 实验组2 实验组3 结 论 预期一 + + + + 预期二 + + — — 预期三 + — + — 预期四 + — — — 既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因 只含有抗四环素基因 只含有抗氨苄青霉素基因 既不含有抗四环素基因也 不含有抗氨苄青霉素基因 例题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论 以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析： ①GC… ②AATTC… ③ …GC ④ …CTTAA CG… G… …CG …G (1)其中①和 是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用DNA连接酶通常是 。 （2） 和 是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是 。 例题 本节内容小结： 1.知识梳理： DNA重组技术的基本工具： ①限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键； ②DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸之间的磷酸二酯键； ③基因进入受体细胞的载体（分子运输