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基于高通量测序的野生毛葡萄转录组数据分析 　　摘要：利用RNA-seq技术对所构建的野生毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）叶片的转录组进行测定，对原始reads进行过滤和组装，得到了35 238条质量较高的unigene，平均长度为1 081 nt，N50为1 735 nt。基于NCBI蛋白质数据库（Nr）、蛋白质序列数据库（Swiss-Prot）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库和直系同源基因簇（COG）进行相似性比对，共注释了26 751条unigene，另有8 487条unigene未被注释。物种同源性显示与葡萄的同源性最高为74.48%。利用COG数据库将unigene分成25类，通过GO分类和KEGG富集性分析，将unigene分别归类于44个GO类别和122个代谢途径。此外，在35 238条unigene中共有哪些信誉好的足球投注网站到4 428个SSR位点，二核苷酸的SSR数目最多（1 906条），其次为三核苷酸（1 762条）。这些信息为毛葡萄功能基因、相关候选基因的发掘以及分子标记辅助育种提供了重要依据。 　　关键词：毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）；转录组；高通量测序 　　中图分类号：S663.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4827-05 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.050 　　野生毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）是葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis）真葡萄亚属（Euvitis）东亚种群，盛产于中国，是中国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种[1]。广西壮族自治区作为中国野生毛葡萄之乡和中国野生毛葡萄酒原产地，在桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地区野生毛葡萄较集中。野生毛葡萄含多种维生素、各种氨基酸、矿物质等营养物质，还含有丰富的花色素双糖苷、超氧化歧化酶（SOD）及白藜芦醇（RES）物质，具有软化血管、抗衰老、防癌的作用[2]。多数野生毛葡萄表现抗逆性强、耐病性好、耐南方高温多雨潮湿天气、耐旱耐瘠等优良特性，是南方石漠化治理、生态重建的优良树种，具有重要的经济价值[3，4]。目前对毛葡萄的研究主要集中在栽培技术和杂交育种方面，缺乏对其分子生物学方面的研究，对其基因信息的研究极少。 　　转录组是在特定发育阶段和一定生理条件下，细胞内所有转录出来的RNA的集合。通过高通量的转录组分析，可以获得机体在生命过程中基因的表达模式[5]。RNA-seq是2008年建立起来的基于深度测序的转录组分析技术，它能够在单核苷酸水平上对任何物种进行整体转录活动的检测，是当前在全基因组水平上研究基因表达模式的主要技术[6]。本研究拟采用RNA-seq技术对所构建的毛葡萄叶片的转录组进行测定，并在基因组水平上进行转录组分析，旨在获得毛葡萄更多的转录本和更为全面的转录组信息，为重要性状相关基因的克隆及功能分析、鉴定次级代谢物生物合成相关基因奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　植物材料为毛葡萄五峒-1，生长于广西壮族自治区河池市都安瑶族自治县高岭镇五峒村，树龄数十年、生长旺盛，叶片生长状况良好，果实产量高，经调查与试验发现其对多种病害高抗或免疫。采集后液氮速冻，并转移至-80 ℃水箱保存备用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 野生毛葡萄测序 采取野生毛葡萄的嫩叶并提取总RNA，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行文库构建与高通量测序，测序平台为Illumina HiSeq TM 2000，每个样品测序量约为4.75 G。 　　1.2.2 测序数据的组装 对测序后得到的原始数据total raw reads进行质量分析，去除重复、含接头、测序质量低的reads，获得clean reads。使用短reads组装软件Trinity做转录组从头组装[7]。首先将具有一定长度重叠的reads连成更长的片段，通过reads重叠关系得到组装片段contig。然后将reads比对回contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同contig以及这些contig间的距离，Trinity软件将这些contig连在一起，最后得到两端不能再延长的序列，即为unigene。 　　1.2.3 功能注释 利用Blastx将unigene序列与Nr（Non-redundant Protein Sequence Database in GenBank）、Swiss-Prot（Swiss-Prot Protein Sequence Database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene