第6章酶的分子修饰学案.ppt

第六章 酶的分子修饰 酶的化学修饰 2. 酶的分子定向进化 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 第一节 酶的化学修饰 广义：凡涉及共价部分或部分共价的形成或破坏的转变。 狭义：较温和的条件下，以可控的方式是一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸或其功能基团发生共价的化学改变。 酶的化学修饰的功能 1）催化机理的研究 通过对特定基团侧链的化学修饰，可比较方便的获得有关必需基团的性质，配合以保护手段还可以了解活性部位的信息。 2）有目的对目标基团进行基团改造或保护，可有目的的改变酶的活性。 3）改变酶的生理生化性质，如稳定性、最适pH、抗原性、实现特定目的的研究或应用目的。 一、酶化学修饰方法及修饰剂 修饰剂的要求 反应条件的选择 酶修饰方法 酶学性质 1、影响酶化学修饰的主要因素 （1）影响酶蛋白功能基团反应性的因素 ①微区的极性 ②蛋白质中酚基和羧基相互作用中，羧基pKa低于正常值，而酚基的pKa高于正常值。 ③静电效应 ④位阻效应 2、修饰剂的反应性 选择吸附 静电相互作用 位阻因素 催化因素 二、 修饰反应专一性的控制 （1）试剂的选择 实验目的不同，对专一性的要求也不同。 （2）反应条件的选择： 不造成蛋白质的不可逆变性。 有利于专一性修饰蛋白质 （3）反应的专一性 ①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 ②选择不同的反应pH ③利用某些产物的不稳定性 ④亲和标记 ⑤差别标记 ⑥利用蛋白质状态的差异 三、修饰程度和修饰部位的测定 （1）光谱法 （2）化学修饰数据的分析 ①化学修饰的时间进程分析 ②确定必要基团的性质和数目 设计酶化学反应时应注意 酶性质的了解 酶活性部位情况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此，对酶活性中心的组成，例如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其侧链基团参与了酶的活性中心．是否需要辅因子，为何种辅因子等情况，需要了解，此外，还需要了解酶的分子大小、形状、寡聚酶的亚基组成等。 酶的稳定条件、酶反应最适条件 酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及pH范围以及最适温度、最适pH的情况，酶蛋白解离时的电学性质，酶蛋白水解部位，抑制剂的性质等应有所了解。 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 酶侧链基团的性质及反应性 选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。 二、 酶分子侧链基团的化学修饰 酶分子侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。 1、几种重要的修饰反应 （1）酰化及其相关反应 试剂特点：含有酰基结构，C上带有部分正电荷。 这类试剂作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化，酰基接到亲核原子上。 可作用基团包括： 氨基，作用后形成酰胺；巯基：作用后形成巯酯；醇羟基（丝氨酸、苏氨酸）：作用后形成酯；酚羟基（酪氨酸）：作用后形成酚酯。 酰基化反应中的X既可以是卤素，也可以是某些吸电基团，如咪唑基。 （2）烷基化反应 试剂特点：烷基上带有活泼卤素，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷。 该类试剂作用于侧链基团的亲核基团，使之烷基化，烷基连接在亲核原子上。 可作用基团包括：氨基（赖氨酸、精氨酸），巯基（半胱氨酸）、羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑基（组氨酸） （3）氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性 这类试剂作用于侧链基团，可被氧化的基团包括巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、咪唑基、二硫键等。 而被还原的基团主要是二硫键。 连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，可用于保护巯基。 （4）芳香环取代反应 试剂：卤（碘）化、硝化试剂。 该类试剂作用于酪氨酸的OH邻位。 2、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 通过选择性的试剂或者亲核试剂与酶上特定的侧链基团进行化学修饰是酶分子化学研究的重要方法，也是改造酶的性质和功能的重要手段。 20种氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链容易被修饰，它们一般具有亲核性。 从酶动力学的角度，酶必需基团的化学修饰的过程是不可逆抑制（激活）过程。 （1）巯基的化学修饰 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。 巯基修饰可以分为以下几种：二硫键交换、重金属化合物作用、烷基化、酰基化。 二硫键交换 E-SH+R-S-S-R----E-S-S-R+R-SH