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对粉尘螨过敏原蛋白Derf3的活性鉴定研究 　　前言 　　尘螨可诱发过敏性皮炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病，且哮喘的发病率与尘螨的消长呈一定的比例关系。现已发现20 多种尘螨过敏原组分，其中1、2 组分占主要地位。但缺乏1、2 组分的尘螨浸液仍能诱发哮喘，说明其它组分在致敏的过程中也发挥了重要作用。粉尘螨过敏原Derf 3 能够介导机体产生过敏反应，目前对其研究相对较少。因此，研制具有生物学活性的粉尘螨过敏原蛋白Der f 3 对揭示螨虫过敏的机制与规律具有重要的意义。本研究旨在利用原核表达体系重组表达过敏原蛋白Der f3，利用特异性荧光底物Boc-Gln-Gly-Arg-MCA 鉴定其酶学活性。另外，通过ELISA 试验检测蛋白的免疫学活性，以期获得具有较高活性的目的蛋白，为生产高质量的诊断试剂和疫苗奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌种含有目的基因 　　Der f 3 的菌种RosettapET44a-Der f 3 由本实验室构建保存。 　　1.1.2 患者血清试验 　　所用血清来自广州医科大学附属第二医院过敏反应科的就诊患者(获得患者知情同意)血清入选标准：1)UniCAP 过敏原筛查试验中粉尘螨过敏程度4 级以上(总IgE 水平ge;17.5 KU/L)病人样本;2)病人出现粉尘螨过敏引起的一系列临床表现：如过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等疾病的临床症状。阴性对照血清入选标准：UniCAP 过敏原筛查试验中检测粉尘螨过敏阴性的样本(总IgE 水平gt;50 KU/L)。收集到的血清分装后置-20℃保存。 　　1.1.3 主要试剂和仪器 　　StrepⅡ标签抗体购自Merck 公司，StrepTrapHP 预装柱为GE Healthcare 公司生产，荧光底物Boc-Gln-Gly-Arg-MCA 购自日本Peptide 公司，Varioskan Flash多功能酶标仪产于美国赛默飞世尔科技公司，TMB 购自赛默飞世尔科技，PCR 试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由上海博尚生物技术有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 表达质粒的鉴定 　　以目的基因序列为模板设计引物，上游引物为5#39;GGAGATATACATATGGCTACACCGATTC3#39;，下游引物为5#39;CGTTTTGATTCAATCCAATCGACAAAATTACC3#39;，用以下PCR 扩增程序鉴定表达质粒：预变性：95 ℃ 5 min;变性：95℃ 30 s;退火：55℃ 30 s;延伸：72℃ 40 s(循环扩增30次);最后72℃延伸5 min。用1 %的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。 　　1.2.2 目的蛋白的表达对PCR 鉴定结果 　　阳性的菌落按照1:100 比例接种于Amp(50 mg/L)抗性的LB 培养基扩大培养，待细菌培养至对数期(OD 0.6-0.8)时加入0.1 mmol/L IPTG 诱导表达4 h。 　　1.2.3 目的蛋白的复性纯化与鉴定 　　超声破碎诱导表达后的菌体，10000 rpm 4 ℃离心30 min 收集包涵体。按l:100 的比例将其溶解于8 mol/L 尿素结合缓冲液中(1times;结合缓冲液、8mol/L Urea、pH 8.0)，室温搅拌溶解1 h 后离心，取上清装入透析袋，4℃条件下按照6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0mol/L 的尿素浓度梯度透析(4 h 换一次液)，离心收集上清得到透析复性后的蛋白。用1times;结合缓冲液(1.5 mM NaCl、100 mMTris-HCl、1 mM EDTA)平衡亲和层析柱后，将蛋白样品注入上样环，用洗脱缓冲液(2.5 mmol/L 脱硫生物素、1times;结合缓冲液、pH 8.0) 洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。目的蛋白经12 %SDS凝胶电泳(浓缩胶80 V 20 min;分离胶160 V 40min)后转到PVDF 膜上通过Western Blot 试验进行鉴定，一抗采用生物素标记的抗StrepⅡ抗体(1:2500 稀释)，4 ℃孵育过夜;二抗采用HRP 标记的马抗鼠IgG 二抗(1:5000 稀释)，室温孵育1 h，用四甲基联苯胺底物显色，化学发光成像仪Las400Mini 显像。 　　1.2.4 酶学活性的鉴定 　　对Der f 3 蛋白原液按1:0、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32 的比例进行稀释，分别取10 mu;L 蛋白样品加入2mL 反应体系中(50 mmol/L